NYT 1466-2007动物棘球蚴病诊断技术.pdf

ICS 11.220B 41NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 1466—2007动物棘球病诊断技术Diagnostic techniques for animal echinococcosis2008-03-01实施2007-12-18 发布中华人民共和国农业部发布 NY/T 1466--2007前言本标准的附录 A、附录 B和附录 C，均为规范性附录本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位：中国农业科学院兰州兽医研究所。本标准主要起草人：贾万忠、田广孚、才学鹏。I NY/T 1466—2007动物棘球病诊断技术1范围本标准规定了用于绵羊和牛棘球坳病间接血球凝集试验(IHA)和酶联免疫吸附试验(ELISA)两诊断方法的要求。本标准用于检测血清抗体,适用于绵羊和牛棘球坳病大批量样品的普查，包括棘球蜘病的流行病学调查、动物生前诊断和检疫。2间接血球凝集试验(IHA)2.1材料2.1.1待检样品的采集和处理采集动物血清作为检测材料。加 NaN:（终浓度0.01%)或硫柳汞(终浓度0.01%)防腐。4℃冷藏保存。2.1.2囊液采集与处理以无菌方法从直径在3cm以上含有棘球蚜育囊的包囊中抽取囊液,采集多个包囊的囊液混合后使用。囊液应清亮，呈无色或淡黄色。4℃，3000r/min离心20min;取上清液，4℃用40%的聚乙二醇（分子相对质量8000～20000)浓缩10倍；再用无离子水和生理盐水交替透析48h充分除盐；4℃，3000r/min离心20 min;取上清液，用紫外吸收法测定蛋白含量，调整浓度为5mg/mL;加NaN3（终浓度为0.01%），分装后一20℃保存备用。2. 1. 3阳性参考血清制备用棘球囊液抗原免疫羊和牛制备，血清抗体的IHA效价为1：1024～1：4096。2. 1. 4阴性参考血清制备健康羊、牛血清,抗体 IHA效价在1：16以下。2.1.5IHA 诊断液制备制备方法见附录 A。2.1.6微量反应板72孔(12×6)或96孔(12X8)V型。2.2操作方法2.2.1 试验设置将血凝板的一行或两行作为对照孔，其余各行为加样孔。2.2.2稀释血清和加样用pH7.2、0.15mol/LPBS稀释液将待检样品按4倍系列稀释为1：4、1：16、1：64和1：256四个滴度,每个滴度在加样孔各加1孔。阳性参考血清按 4倍系列稀释为1：4、1：16、1：64、1：256、1：1024、1：4096和1：16384共7个孔，加至对照孔；阴性参考血清稀释同待检血清，加至对照孔。稀释液对照孔只将稀释液加1孔至对照孔。每孔加样量均为25μL。2.2.3加诊断液各孔加 IHA诊断液,加样量每孔25μL。2. 2. 4 血凝反应试验微量板置振荡器上振荡 1min～2 min，使诊断液中的血球分布均匀，从振荡器上取下，用干净1 NY/T 1466—2007的玻璃板盖住反应板,放室温(18℃～25℃)反应2 h～3 h。2.3结果判定2.3.1试验成立条件当稀释液对照不出现凝集，阴性参考血清不高于1：16 和阳性参考血清抗体效价为产品规定值(1：1024～1：4096)三项条件同时满足时，试验成立。2.3. 2 判定“十十十十”100%的血球在孔壁下形成呈均质膜样凝集。边缘整齐,致密。“十十十”75%的血球在孔壁下形成呈膜样凝集,不凝集的血球在孔底中央集中成很小的圆点。“十十”50%的血球在孔壁更下部形成呈稀疏凝集，不凝集的血球在孔底中央集成较大圆点。“十”25%的血球在孔底凝集,不凝集的血球在孔底中央集中成大圆点。“一”所有血球均不凝集,并集中于孔底中央成最大的圆点。2.3.3阳性判定标准使用V型板，以“十十”为阳性终点。待检样品抗体滴度等于或高于阳性规定值(1：64)时,判定为阳性;待检样品抗体滴度低于 1：64 即第三孔(1：64稀释)为“十”或“一”者,判定为阴性。3酶联免疫吸附试验(ELISA)3.1材料3.1.1动物血清样品的采集和处理同2.1.1。3.1.2抗原为醋酸盐纯化抗原。3. 1.3 阳性参考血清同2.1.3。3. 1. 4阴性参考血清同2.1.4。3.1.5试验溶液详见附录 B。3.1.6 抗免疫球蛋白一酶结合物可从生化试剂公司购买，也可自行制备(详细方法见附录C)。3.1.7微量反应板40孔或96孔聚苯乙烯微量酶标板。3.2操作方法3.2.1抗原包被用包被缓冲液将抗原稀释至工作浓度（1 μg/mL～10 μg/mL），每孔加 100 μL。空白对照孔加100μL包被缓冲液（无抗原），4℃过夜。3.2.2洗涤试验开始先洗涤包被的ELISA板，弃孔内包被液，拍干。用洗涤缓冲液洗3次，每次各孔加满洗涤缓冲液后停留 3min,甩干。洗涤 3次后,在吸水纸巾上拍干。3.