NY_T 2864-2015葡萄溃疡病抗性鉴定技术规范.pdf

ICS 65.020B 16NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 2864—2015葡萄溃疡病抗性鉴定技术规范Technical specification for evaluation of grape resistance to grapevine dieback2015-12-29发布2016-04-01实施中华人民共和国农业部发布 NY/T2864---2015前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由农业部种植业管理司提出。本标准由全国果品标准化技术委员会（SAC/TC510)归口。本标准起草单位：北京市农林科学院。本标准主要起草人：李兴红、燕继哗、张玮、严红、乔广行 NY/T2864--2015葡萄溃疡病抗性鉴定技术规范1范围本标准规定了葡萄抗溃疡病（grapevinedieback）鉴定方法和评价方法。本标准适用于葡萄(VitisL.）抗溃疡病的室内鉴定及抗性评价。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3. 1葡萄溃疡病grapevine dieback由葡萄座腔菌科(Botryosphaeriaecae)真菌引起的葡萄真菌性病害。注：病原菌危害果穗和枝条，果实在转色期表现症状，穗轴出现黑褐色病斑，向下发展引起果梗干枯致使果实腐烂脱落或干缩；危害枝条引起溃疡斑，有时病斑上着生许多黑色小点，严重时还可造成整个植株枯死。该病在我国主要由可可毛色二孢Lasiodiplodiatheobromae和葡萄座腔菌Botryosphaeriadothidea引起3. 2分生孢子器真菌的一种无性子实体，由菌丝体构成，近圆形，顶部有一小孔口，内壁生有许多短小的分生孢子梗，梗上长有分生孢子。3. 3抗性评价evaluation of resistance根据采用的技术标准判别植物寄主对特定病虫害反应程度和抵抗水平的描述4试剂与材料除非另有说明，本规范所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的三级水。4.1马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g。将马铃薯去皮、切成小块，用水煮沸30min，纱布过滤，加入葡萄糖和琼脂粉，滤液定容至1000mL，121℃高压灭菌20min4.22%水琼脂培养基(WA)培养基琼脂20g，用水定容至1000mL，121℃高压灭菌20min。5仪器设备5.1恒温培养箱温度范围：0℃～50℃，温度波动：士1℃。5.2光学显微镜 NY/T 2864—-2015目镜：10×；物镜：10×，40×。5.3超净工作台洁净等级：100级@≥0.5um，平均风速：0.25m/s~0.6m/s。5.4高压灭菌锅温度范围：0℃～135℃，灭菌时间范围：4min～120min，最高工作压力：0.22MPa～0.25MPa。5.5干热灭菌箱温度范围：室温十10℃~250℃，温度波动：士1℃。6接种体制备6.1病菌分离纯化、保存6.1.1病原菌分离培养从葡萄枝干病斑边缘或者发病果梗、果粒的病健交界处剪取大小0.5cm×0.5cm的病组织3块～5块，用75%乙醇溶液消毒90s，然后用灭菌的三级水冲洗3次，用灭菌滤纸将水吸干，置于直径为9cm的PDA平板上，每个平板上放3块。上述操作在超净工作台上无菌条件下完成。恒温培养箱中（28士1)℃培养。6.1.2病原菌纯化病菌分离物培养4d以后，从生长的菌落边缘挑取少量菌丝转入新的PDA培养基上，10d～15d左右，菌落表面开始形成分生孢子器，将分生孢子器转移至75%乙醇溶液消毒处理的载玻片上，用解剖刀将分生孢子器破碎后转移至含有1mL无菌水的1.5mL离心管中，充分混勾后经2层擦镜纸过滤到一个新的1.5mL离心管中，使用血球计数板计算孢子浓度，用灭菌水配成每毫升含1×104个孢子的悬浮液，吸取100μL孢子悬浮液均匀涂布于2%的水琼脂培养基上，在超净工作台中吹干。（28士1)℃条件下培养至分生孢子萌发，在光学显微镜（物镜：10×，目镜：10×）下镜检，挑取萌发的单个分生孢子置于新的PDA培养基上，（28士1)℃恒温培养，并保存备用。如果分离菌未产生分生孢子，则在水琼脂培养基上培养1d,挑取单菌丝。注：所有试材均需灭菌。6.1.3病原菌保存滤纸片保存将剪至0.5cm²大小的滤纸片、硫酸纸袋以及牛皮纸袋湿热灭菌2次（121℃，20min）。将待保存菌株接种在PDA培养基上，周围摆放绿纸片，（28士1）℃恒温培养，至菌丝长过滤纸片、产生分生孢子器后，用镊子将滤纸片揭下，装入硫酸纸袋。在超净工作台中，将装有带菌滤纸片的硫酸纸袋装入牛