SN_T 1203-2010食用油脂中转基因植物成分实时荧光PCR定性检测方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1203--2010代替SN/T1203-2003食用油脂中转基因植物成分实时荧光PCR定性检测方法Protocol of the real-time fluorescence q ualitative polymerase chainreaction for detecting genetically modified plant components in edible oil2010-11-01发布2011-05-01实施中华人民共和发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1203---2010前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准代替SN/T1203--2003《食用油脂中转基因植物成分定性PCR检测方法》。本标准与SN/T1203--2003相比，主要技术变化如下：重新规范了使用范围为食用植物油脂；重新确定了食用油脂的核酸提取方法；-取代PCR检测技术中常规PCR及荧光PCR（参入法）为实时荧光PCR；调整了定性PCR所用引物、探针序列；重新确定了检测结果判断依据。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局、北京望尔生物技术有限公司。本标准主要起草人：李丹宁、高东微、谢力、钟玉清、钟国强、蔡颖、万宇平、董洁、邓鸿铃、马骏、张隽、陈源树、谢佩心。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：-SN/T1203--2003。 SN/T1203----2010食用油脂中转基因植物成分实时荧光PCR定性检测方法1范围本标准规定了食用油脂中转基因植物成分实时荧光PCR定性检测方法。本标准适用于食用油脂中转基因植物成分实时荧光定性PCR检测。本标准不适用于动物源性油脂中转基因植物成分实时荧光定性PCR检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法GB/T27025检测和校准实验室能力的通用要求GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求SN/T1204植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验方法3术语、定义和缩略语3.1术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1.1DNA 的提取和纯化DNAextraction and purification从测试样品的各种成分中释放DNA随后纯化DNA去除PCR反应抑制剂。3.1.2外源基因exogenous gene利用生物工程技术转人的其他生物基因，使该生物品种表现新的生物学性状。3.2缩略语下列缩略语适用于本文件。EPSPS(5-enolpyruvylshkimate-3-phosphatesynthasegene）：5-莽草酸-3-磷酸合酶基因FAM（6-carboxyfluorescein）：6-羧基荧光素NOS（terminatorofnopalinesynthasegene）：胭脂碱合酶基因终止子TAMRA（carboxy-tetramethyl-rhodamine）：羧基四甲基罗丹明tRNALeu叶绿体亮氨酸转运核糖核酸基因4原理本标准所涉及食用油脂是油料作物加工产品，通常在常温下为油状液体，在油脂的压榨、抽提过程中，部分核酸等极性组分会随油料作物细胞的破坏而进人油液。采用适当的核酸提取技术，获得适用于 SN/T 1203--2010实时荧光PCR检测的DNA，通过实时荧光PCR检测其中是否含有各种外源基因，达到对食用油脂中转基因植物成分定性检测的目的。5材料与试剂5.1设备和材料5.1.1高速冷冻离心机（最高转速52000g）。5.1.2台式离心机（最高转速15000g）。5.1.3冰箱:2℃~8℃、20℃、80℃5.1.4制冰机。5.1.5超纯水发生器（分子生物学级别）。5.1. 6双蒸水器。5.1.7核酸真空干燥系统。5. 1. 8核酸蛋白分析仪。5.1.9实时荧光PCR仪。5.1.10离心管：1.5ml、2mL、15mL、50mL。5.1.11电泳仪。5.1.12电热恒温干燥设备或其他快速干燥设备。5.1.13表面Ⅲ：15cm~20 cm。5.2试剂除另有规定外，所有实验使用的试剂等级应为不含DNA和DNase的分析纯或生化试剂。条件5.2.1许可的情况下推荐使用优级纯试剂。试剂的选购、验收、储存应符合GB/T27025规定。实验用水应符合GB/T6682中-级水的规格。去离子水电阻应达到18.22。5.2.25.2.3食用油脂中植物基因组DNA提取纯化试剂盒。5.2.410×PCR缓冲液（不含氯化镁）。5.2.5氯化镁溶液：25mmol/L5.2.6dNTP溶