NY_T 1963-2010马铃薯品种鉴定.pdf

ICS 67.080B 23NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 1963-—2010马铃薯品种鉴定Cultivar identification of potato2010-12-23发布2011-02-01实施中华人民共和国农业部发布 NY/T1963—2010前言本标准遵照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部种植业管理司提出并归口。本标准起草单位：农业部脱毒马铃薯种薯质量监督检验测试中心（哈尔滨）。本标准主要起草人：吕典秋、王绍鹏、刘尚武、邱彩玲、宿飞飞、李勇、高云飞、王文重、张抒、王亚洲、李学湛。 NY/T 1963—2010马铃薯品种鉴定1 范围本标准规定了马铃薯品种鉴定SSR分子标记方法，本标准适用于马铃薯品种及种质资源鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件，GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB7331马铃薯种薯产地检疫规程GB18133马铃薯脱毒种薯3试剂DNA的提取及PCR扩增所使用的实验室独立，微量移液器为分子检测专用。试验中，溴化乙锭染色剂可诱发基因突变，丙烯酰胺水溶液具有神经毒性，操作人员在操作过程中需佩戴手套和口罩。电泳后的凝胶以及被溴化乙锭污染的物品要有专用收集处，集中进行无害化处理。以下所用试剂，除特别注明者外均为分析纯试剂，水为符合GB/T6682中规定的一级水。3. 11 mol/ L 三羟基甲基氨基甲烷--盐酸(Tris-HCI)溶液(pH 8. 0)称取Tris碱121.1g，溶解于800mL水中，用浓盐酸调pH至8.0，加水定容至1000mL，121℃高压灭菌20min。3.20.5mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液（pH8.0)称取乙二铵四乙酸二钠186.1g，溶于700mL水中，用氢氧化钠调pH至8.0，加水定容至1000mL。3.3TE缓冲液(pH8.0)量取1mol/L三羟基甲基氨基甲烷一盐酸(Tris-HCI)溶液(3.1)2mL、0.5mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液（3.2)0.4mL，加水溶解，定容至200mL，121℃高压灭菌20min后，室温保存。3.45×Tris-硼酸(TBE)电泳缓冲液称取Tris碱27g、硼酸13.75g，量取0.5moi/L乙二铵四乙酸二钠溶液（3.2)10mL，加灭菌双蒸水400mL溶解，定容至500mL。3.51XTris-硼酸(TBE)电泳缓冲液量取5×Tris-硼酸（TBE）电泳缓冲液（3.4)200mL，加水定容至1000mL。3.6样品提取缓冲液称取氯化钠15.2g、十二烷基磺酸钠(SDS)0.4g、聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)2g、二硫苏糖醇(DTT)0.309g，溶于100mL双蒸水中，再加人0.5mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液（3.2）20mL、1mol/L三羟基甲基氨基甲烷一盐酸（Tris-HCI)溶液（3.1)20mL、TritronX1001mL、β-巯基乙醇0.8mL，混合均匀，加水定容至200mL，4℃贮存待用。3.7Tris饱和酚十三氯甲烷十异戊醇混合液（现用现配）量取Tris饱和酚25mL、三氯甲烷24mL、异戊醇1mL，混合均匀待用。1 NY/T 1963-20103.830%丙烯酰胺溶液称取丙烯酰胺29g、N，N-亚甲基双丙烯酰胺1g，加水溶解，定容至100mL，过滤，4℃储存。3.910%过硫酸铵溶液（现用现配)称取0.1g过硫酸铵，加水溶解，定容至1mL。3.1012%聚丙烯酰胺凝胶(双板）)量取30%丙烯酰胺溶液（3.8)20mL、5×Tris-硼酸（TBE)电泳缓冲液（3.5）10mL、灭菌双蒸水25mL、四甲基乙二胺（TEMED)50μuL，混匀，制板前加过硫酸铵溶液（3.9)500uL，混匀，灌胶。3.11溴化乙锭贮液（10mg/mL）称取溴化乙锭200mg，加水溶解，定容至20mL。3.12溴化乙锭染色液(0.5μg/mL)量取溴化乙锭贮液（3.11)10μL，加水定容至200mL。3.133mol/L乙酸钠溶液(pH5.2)称取乙酸钠·3HzO24.6g，加水80mL溶解，用冰乙酸调pH至5.2，定容至100mL。3.14100bpDNA分子量标准物3.15SSR标记引物序列情况见附录A。4仪器4.1分析天平（感量0.0001g）。4.2台式低温高速离心机(≥12000r/min)。4.3微量移液器(0.5μL～10μL、10μL～100μL、20μL～200μL、100μL1000μL)。4.4冰箱（4℃、一20℃）。4. 5稳压稳流电泳仪、水平板电泳槽、垂直板电泳槽。4.6液氮罐。4.7#紫外凝胶成像仪。4.8IPC