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中药复方的体外细胞生物学研究 在现代医学研究的历史上，体内实验（inov）和室外实验（invito）是不可分割的两个方面。体外实验的结果最终要通过体内实验来证实其价值,由此可见体内实验尤为重要。然而,体外实验以实验条件和因素易于控制、需要时间短,便于进行作用机制的实验设计、避免体内实验的伦理学问题等优点发挥了极为重要的作用。 中药复方在中医及中西医结合临床实践中主要的用药方式。在体外实验中,主要有将中药复方或单方的提取物直接或精炼后加入体外细胞培养系统中,及中药血清药理学等方法。但这些方法有其优越性及局限性,使得用体外细胞培养来研究中药复方的工作进展较缓慢。尽管存在许多困难,但在这一领域中医学工作者仍做了大量工作。本文就这一领域对国内外的研究进展作一综述。 1 中药复方作用时间 可采用外周血单个核细胞、巨噬细胞,也有的采用体细胞(如肾上腺嗜鉻细胞、人脐静脉内皮细胞、人乳腺细胞等),另一大类为肿瘤细胞。确定适宜溶媒,再检查细胞活性。溶媒液体各不相同,一般中药复方直接用DMSO、PBS或细胞所需基础培养液相溶,或将其含药血清的培养液直接加入细胞。 中药复方作用时间各家报道不一,有与中药短时间作用(30min或2h),一般选择作用在24~72h。中药的有效作用浓度依提取、制备方法的不同变化较大,但多数具有浓度依赖性。含药血清作体外细胞培养时,一般认为其浓度不应超过20%为宜。 2 中药复方的制备和作用 2.1 中药原液的制备 对用于细胞培养的中药复方有较高的要求。用蒸馏水煎煮回流后,有的直接采用水煎液,更多的用水提醇沉提取液,过滤、浓缩,制成中药原液;或是用以上方法干燥成粉,用适宜溶媒制成供体外细胞培养用的中药原液。实验前还需用微孔滤膜或高温除菌。 2.1.1 制备在心肌细胞中的不同浓度设备液对大鼠心肌细胞的保护作用 以血府逐瘀汤制成的水煎剂与血小板和人脐带内皮细胞共育,在40mg/ml及80mg/ml浓度时可明显抑制二磷酸腺苷诱导的血小板表达糖蛋白复合物分子的表达,因而可抑制ADP对血小板的激活。由人参、麦冬、丹参、赤芍、瓜蒌皮、金银花、苦参等组成的清心饮水煎醇沉提取液于大鼠心肌细胞培养3~5天,在2.5~10mg/ml浓度范围内能够剂量依赖性地减少感染心肌细胞乳酸脱氢酶、天冬氨酸氨基转移酶的释放,降低上清液中的病毒滴度,对心肌细胞搏动异常及细胞病变均有保护作用。 运用流式细胞仪对临床治疗原发性肺癌的有效复方进行了拆方研究,24味中药的水提醇沉提取液10mg/ml处理肺腺癌细胞株24h,其中对细胞增殖指数抑制率在20%以上的4味中药中,有3味药是扶正药(绞股蓝、北沙参、人参),提示扶正法治疗肿瘤并不一定意味着传统意义上的“补”,一些补益药亦能直接抑制肿瘤细胞增殖。 2.1.2 小柴胡汤的保护 日本学者将小柴胡汤(100μg/ml)对人肝癌细胞株(KIM-1)和胆管细胞癌株(KIC-1)在体外与不同浓度的小柴胡汤作用3天后,其生长受到不同程度的抑制。其50%抑制浓度的中药培养液的渗透压和p H值皆属于正常范围,并且该浓度范围内的小柴胡汤对健康人的外周血淋巴细胞和鼠肝细胞无抑制作用。以小柴胡汤的各种主要成分以及另一种中药复方作为试剂对照,表明小柴胡汤的抑制作用明显强于其各种主要成分(P0.05)和另一种中药复方(P0.01),说明小柴胡汤的作用具有协同性和特异性。 2.1.3 rcm-119对醇、pbs和dmso的增殖作用 研究表明,同是藏药PADMA28分别用乙醇、甲醇、DMSO、PBS溶解分别作用在CEM-C7H2细胞。使用前离心2000r/min,10min,微孔滤膜过滤,保存在-20℃备用。等倍稀释后检测细胞毒作用,结果显示用醇稀释的优于PBS、DMSO,DMSO单独没有显示毒性作用。在1∶200~1∶500浓度范围内能够剂量依赖性地抑制增殖作用,使细胞处于G1期。 RCM-101是一种含有18味中药的复方,沸水煎煮1~1.5h后,在50~60℃煎煮2~5h,1g溶液含有5g生药,冷冻干燥成粉。分别用乙醇、PBS溶解,使用前离心5000r/min,10min,微孔滤膜过滤,保存在-20℃备用。等倍稀释后检测细胞毒作用,选取1、10、100μg/ml浓度。在此范围内能够剂量依赖性地抑制前脂肪细胞的产生,但不同浓度的作用点不同,100μg/ml可以抑制COX-2的表达但不影响COX-1,其他的浓度则可以同时抑制COX-1与COX-2的表达。 2.2 中药对mc细胞增殖的诱导分化作用 血清药理学方法的药物制备则是先给供体按临床用药量(志愿者),或临床等效剂量(动物)给药,给药一定时间后采血分离血清。含药血清被分离后,置于56℃水浴中灭活;若需长期保存,需冷藏于-20℃以下备用。 用扶正抗癌方(莪术、白术、苦参、白花蛇舌草)给大鼠灌