胶原蛋白的提取、结构以及分子量测量.docVIP

胶原蛋白的提取、结构以及分子量测量 胶原蛋白的提取、结构以及分子量测量综述 一、前言 胶原蛋白(collagen)是与各组织、器官机能有关的功能性蛋白，约占人体总蛋白的三分 [1]之一,存在于细胞外间质，是具有三股螺旋结构的蛋白质家族。胶原是人体重要的细胞外基质成分,在细胞生物学中有重要应用价值。胶原是一个大的蛋白家族，至少有15个型别，各 [2]型胶原都具有一定的分子构型和组织分布特点，其中以?型胶原分布最广，含量最多。 胶原蛋白(或称胶原)是按是否形成有周期性横纹的胶原原纤维(collagenous fibril)可将其分为原纤维胶原蛋白(fibrillar or fibril-forming collagen)和非原纤维收原蛋白(nonfibrillar or non,fibril,forming collagen)两大类。目前己发现的胶原蛋白类型己不下19种，原纤维胶原蛋白包括I、II、III、V、XI型胶原，在体内以胶原纤维的形式存在。胶原纤维是骨骼、肌腱、骨间膜、皮肤、软骨、韧带等器官的基本结构物质，使这些器官具有很高的抗张强度。胶原纤维与组织器官的生物力学特性密切相夫原纤维胶原蛋白包括I、II、III、V、和XI型胶原，其余均属于非原纤维胶原蛋白。非原纤维胶原蛋白具有胶原蛋白的基本特征，即三股螺旋结构，但其结构、分布和功能更具有多样性、非原纤维胶原蛋白按其 ,,27超分了结构可进一步分类。(l)结合于胶原原纤维表面的胶原蛋白(fibril associated collagens with interrupted triple helice FACIT) 包括IX XII XIV XVI X XI型胶原。 (2)形成网状结构的胶原蛋白 包括IV VIII X型胶原。(3)形成串珠状纤维(beaded filament)的胶原蛋白有VI型胶原。(4)形成固着原纤维(anchoring fibril)的胶原蛋白，有VII型胶原。(5)有跨膜区的胶原蛋白，有 XIII和 XVII型胶原。(6)结构尚未明确的胶原蛋白包括XV和XVIII型胶原等。 胶原不仅作为组织的支持物，而且对细胞、组织乃至器官行使正常功能及伤口愈合都有重大影响。胶原作为医用生物材料比以往应用的金属、陶瓷或化学材料具有更大的优越性，因此近20年来已被广泛用于临床(近年来，世界各国已将胶原制品广泛应用于临床修复软组织缺损，覆盖烧伤创面、整形、牙周引导组织再生、口腔种植体、牙槽嵴再建及颌骨空腔修复。 二、胶原蛋白的提取 胶原多从牛皮、肌腱、鼠尾等部位提取，由于胶原是一个大的蛋白家族，是细胞外间质的四大组分之一，几乎分布于所有的组织中。到目前为止已发现脊椎动物的胶原类型达十多种之多，各型作用不一。胶原的异常改变涉及许多纤维化疾病，在肿瘤的发生与转移中，胶原的分布和类型也发生改受。因此在提取时常将各型分别提取。目前从组织提取胶原多采用分级盐析的方法，在酸性条件下，I型和Ill型胶原沉淀的盐浓度临界点相近;在中性条件下，III型和IV型胶原沉淀的盐浓度临界点又很接近。因此提取时难度较大，程序复杂，需过柱纯化，而且花费时间长，易发生胶原变性。主要的提取方法分述如下: I型和II型胶原主要分布于细胞，组织之间及结缔组织间质中，属于间质胶原，在脏器纤维化病理过程中， I型和II型胶原起着重要作用。I型胶原是结缔组织间质中最主要的成分，一般制品多以I型胶原为材料(文献上I型胶原的提取一般采用多次超速高心的办法。 [3]李成章、樊明文从人胚骨中提取了I型胶原，用于胶原制品的制作。采用胚胎骨组织来提取胶原(一般认为骨组织仅含有I型胶原，选用骨组织作为提取原料可省去分型、过柱纯化等烦杂工序，简便经济，易获得纯度较高的I型胶原(他们的方法为将脱钙骨粉浸入0.5mol/LHAc24,48h，取上清缓慢加入研磨精细的NaCl(终浓度为4mol/L)，搅拌过夜离 1 心35 000×g，20min(下同)，去上清，其沉淀物加入0.5 mol/L HAc透析溶解，离心，取上清依次加入0.lmol/LTris,HCI(终浓度为0.01mol/L)，5mol/LNaOH(调pH至7.4)，NaCl(终浓度为4mol/L)，搅拌过夜，离心，去上清(沉淀以4 mol/L NaCI(0.05 mol,L Tris,HCI洗一次，再加0.5mol/LHAC透析溶解，离心去沉淀，上清装入透析袋内，对NaCl溶府透析(平衡后NaCl浓度为1O,)离心去上清，沉淀物用0.5mol,LHAC透析去盐溶解，离心去沉淀，上清浓缩冻干以上所有液体及操作温度均为4?。为提高抽提纯度，骨粉应越细越好，脱钙必须完全(采用EDTA脱钙，可使一些非胶原蛋白，如骨连接蛋白 [4](osteonectin)随