宁波地区耐碳青霉烯类高毒力肺炎克雷伯菌的分子生物学特征研究.docxVIP

? ? 宁波地区耐碳青霉烯类高毒力肺炎克雷伯菌的分子生物学特征研究 ? ? 高 晖，屠艳烨，吴巧萍，李情操，杨 烨，裘雪丹 肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)是一种革兰阴性兼性厌氧菌，常引起多种机会性感染疾病，如肺炎、脑膜炎、肝脓肿等[1-2]。与经典肺炎克雷伯菌不同，高毒力肺炎克雷伯菌可在健康或免疫功能低下的个体中引起侵袭性感染，往往预后较差、致死率较高[3]。以往研究认为高毒力肺炎克雷伯菌对抗生素高度敏感，然而，近年来越来越多的研究发现耐碳青霉烯类高毒力肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistant hypervirulentKlebsiellapneumoniae,CR-hvKP)的存在。兼具耐药性和高毒力的CR-hvKP通常会导致严重院内感染，尤其是院内小规模的流行暴发给临床的抗感染治疗带来严峻挑战[4]。此外，CR-hvKP分子流行特征具有多样性，因此本课题组收集宁波地区3家医院150株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌，通过对宁波地区CR-hvKP耐药基因及毒力基因的分析研究，为本地区CR-hvKP的院感防控及临床抗感染治疗提供理论依据。 1 材料与方法 1.1 菌株来源 收集自宁波市3家医院临床分离的150株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(CRKP)。入选标准：根据美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)M100-S31标准判读，亚胺培南MIC法≥16 μg/mL为耐药[5]；耐碳青霉烯类高毒力肺炎克雷伯菌(CR-hvKP)的判定标准：①亚胺培南MIC≥16 μg/mL；②拉丝实验阳性；③毒力基因rmpA阳性。须同时满足以上3个条件，用WHONET 5.6软件剔除重复分离菌株。 1.2 细菌鉴定及药物敏感分析 采用VITEK 2 Compact全自动微生物分析仪对分离菌株进行鉴定和体外药敏试验，用纸片扩散法(Kirby-Bauer法)进行药敏验证，亚胺培南药敏纸片购于英国Oxoid公司，根据CLSI指南KB法亚胺培南≤13 mm为耐药；质控菌株大肠埃希菌(ATCC25922)和阴沟肠杆菌(ATCC700323)由宁波市临床检验中心惠赠。 1.3 高黏液表型的筛选 将150株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌接种于哥伦比亚血平板中，二氧化碳培养箱35 ℃培养过夜，次日用接种环挑起单一菌落，若两次挑起形成的黏液丝长度≥5 mm，则为拉丝实验阳性。 1.4 细菌DNA提取 从哥伦比亚血琼脂平板上挑取单个菌落置于含250 μL灭菌蒸馏水的灭菌EP管中，震荡混匀后100 ℃高温金属浴加热煮沸10 min，经12 000 r/min高速离心5 min后，吸取上清至1.5 mL灭菌EP管中，保存在-20 ℃冰箱备用。 1.5 菌株血清荚膜型及毒力基因检测 利用PCR扩增技术检测CR-hvKP的6种常见荚膜多糖基因K1、K2、K5、K20、K54、K57；常见毒力基因包括荚膜多糖生成调节基因(rmpA、magA)、铁载体基因(aerobactin、kfu、entB)、菌毛定值与黏附基因(ureA、fimH、kpn、allS、mrkD)、脂多糖形成相关基因(uge、wabG)，扩增引物序列参照文献[6-8]，部分引物由上海生工生物工程有限公司设计合成(表1)；整合子intI1型引物序列为F：CCAAGCTCTCGGGTAACATC；R：CCCGAGGCATAGACTGTA；intI2、intI3型引物参见文献[9]。PCR反应体系：DNA模板3 μL，上下游引物各1 μL，Tag酶10 μL，加ddH2O至25 μL；反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃延伸5 min。 表1 CR-hvKP常见毒力基因引物Tab.1 CR-hvKP common virulence gene primers 1.6 碳青霉烯类耐药基因检测 利用PCR扩增技术检测碳青霉烯类相关耐药基因，耐药基因包括A类的碳青霉烯酶(KPC)；B类的亚胺培南酶(IMP)、新德里金属β-内酰胺酶(NDM)、维罗纳整合子编码金属β-内酰胺酶(VIM)；D类的苯唑西林酶48(OXA-48)，引物序列参照文献[10]。PCR反应体系为：DNA模板1 μL，上下游引物各1 μL，Tag酶12.5 μL，加ddH2O至25 μL；反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。 1.7 PCR扩增产物电泳 电压110 V，电泳时间15 min。电泳结束后用凝胶成像仪拍摄电泳图，并将目的条带送去上海生工生物工