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精品文档 精品文档 精品文档 精品文档 精品文档 精品文档 精品文档 精品文档 第二章 Enzymes 第四节DNA连接酶Ligase 一、DNA连接酶的发现 二.连接条件 必须是两条双链 DNA。 DNA3 端有游离的-OH, 5端有一个磷酸基团 (P)。 需要能量。 三、连接反应的机理 1、ATP (NAD+)提供激活的AMP。 2、ATP与连接酶形成共价“连接酶 -AMP ”复合物， 并释放出焦磷酸PPio 3、AMP与连接酶的赖氨酸-氨基相连。 4、AMP随后从连接酶的赖氨酸 -氨基转移到 DNA 一条链的5端P上，形成“ DNA-腺甘酸”复合物。 5、 3 -OH对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二脂键， 释放出AMP。 Ligase ：只连“Nick 切口，不连Gap 缺口” .两种DNA连接酶 E. Coli DNA ligase 来源：E.coli 适用：粘T末端(PEG与高浓度一价阳离子存在可连 平末端) T4 ligase 来源：T4 phage 适用：粘性末端 及平末端 T4 vs. E.coli T4 DNA ligase制备容易，价格便宜，能进行各种类型 连接反应，应用更广泛！ .Ligase的反应温度 最佳温度： 界于酶作用速率和末端结合速率之间，一般认为是 4-15 C比较合适。 .DNA分子连接的四种形式 .粘性末端；2.平末端；3.平末端加尾；4.平末端