DB35T 1621-2016水禽1型甲肝病毒亚型感染诊断技术.docxVIP

ICS 11.220 B 41 福 建 省 地 DB35 方 标 准 DB35/T 1621—2016 水禽 1 型甲肝病毒亚型感染诊断技术 Diagnostic Protocol for subtype of duck hepatitis A virus type - 1 infection in waterfowl 2016 - 12 - 30 发布 2017 - 04 - 01 实施 福建省质量技术监督局 发 布 目 次 前言 II 1 范围 1 2 疫病概述 1 3 临床诊断 1 4 反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR) 诊断 2 附录 A (规范性附录) 相关试剂的配制 4 附录 B (资料性附录) RT-PCR 检测结果电泳图例 6 附录 C (资料性附录) 水禽 1 型甲肝病毒亚型 VP1 基因序列 7 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009 《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写》给出的规则起草。 本标准由福建省农业科学院提出。 本标准由福建省农业厅归口。 本标准起草单位：福建省农业科学院畜牧兽医研究所、福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心。 本标准主要起草人： 黄瑜、傅光华、傅秋玲、白泉阳、施少华、程龙飞、万春和、陈红梅、陈珍、 朱春华、陈翠腾、刘荣昌、潘飞龙。 水禽 1 型甲肝病毒亚型感染诊断技术 1 范围 本标准规定了水禽1型甲肝病毒亚型感染的临床诊断要点及病毒核酸检测的反转录-聚合酶链式反 应(RT-PCR) 的操作技术规程。 本标准适用于水禽1型甲肝病毒亚型感染的临床诊断和实验室诊断。 2 疫病概述 水禽1型甲肝病毒亚型感染，俗称水禽胰腺炎，是由不同于致雏鸭典型肝炎(肝脏肿大、出血) 的 鸭1型甲肝病毒(DHAV- 1) 的鸭1型甲肝病毒亚型(DHAV- 1a) 引起雏鸭(鹅) 胰腺发黄、出血为特征 的新发疫病。 该病最早于2011年9月发生于我国福建、浙江两省的雏番鸭群，一年四季均有发生， 其发病率和病 死率分别为30%~43% 、60%~78%不等。其全基因组序列与经典的肝炎型DHAV- 1参考毒株核苷酸序 列和氨基酸同源性分别介于93.5%~99.6%和97.9%~99.6%之间， 与经典的肝炎型DHAV- 1间的抗原亲 缘值(R)为0.62 (介于0.32~0.70间) ；其特征性剖检病变为胰腺发黄、出血，完全不同于引起典型肝 炎的DHAV- 1所致的肝脏肿大、出血特征病变，且在易感动物上也存在明显差异， 雏番鸭、雏半番鸭和 雏鹅对该病较易感、北京樱桃谷雏鸭和雏麻鸭对该病不易感， 而经典的肝炎型DHAV- 1却反之。 3 临床诊断 3.1 临床症状 当雏鸭(鹅)出现以下部分或全部临床症状时，可作为初步诊断的依据： a) 采食或(和)饮水量下降； b) 表现沉郁或扎堆； c) 出现死亡。 3.2 剖检病变 当雏鸭(鹅)出现以下肉眼剖检病变时， 可作为初步诊断的依据： 病死雏鸭(鹅) 胰腺发黄或(和) 存在散在出血点或(和)出血灶。 3.3 初步诊断 当雏鸭(鹅) 出现3.1描述的部分或全部临床症状或(和) 3.2描述的剖检病变时， 可作出初步诊断； 确切诊断需通过实验室做进一步检测。 4 反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)诊断 4.1 样品采集与处理 尽量采集发病、濒死或病死雏鸭(鹅) 的胰腺组织样品， 尽快处理， 即将采集的组织样品剪碎， 与 磷酸盐缓冲液(PBS ，配制方法见附录A. 1) 按照体积比1:3的比例制成组织匀浆液，反复冻融3次， 8 000 r/min离心30 min，取上清， 用于RNA抽提， 或置-20 ℃冻存备用。若在6 h以上处理的样品， 应先 置-20 ℃条件下保存备用， 需托运时应确保冷藏或冰冻状态运输。 4.2 仪器设备 4.2.1 PCR 仪。 4.2.2 高速台式冷冻离心机。 4.2.3 微量移液器。 4.2.4 组织匀浆器。 4.2.5 电泳仪。 4.2.6 电泳槽。 4.2.7 紫外凝胶成像系统。 4.3 试剂 4.3.1 RNA 提取试剂 Trizol。 4.3.2 三氯甲烷。 4.3.3 异丙醇。 4.3.4 焦炭酸二乙酯(DEPC) 处理水： 配制方法见附录 A.2。 4.3.5 75%乙醇： 配制方法见附录 A.3。 4.3.6 溴化乙锭溶液： 配制方法见附录 A.4。 4.3.7 1×TAE 缓冲液：配制方法见附录 A.5。 4.3.8 1.0%琼脂糖凝胶：配制方法见附录 A.6。 4.3.9 DNA 相对分子质量标准物