常用实验基本技术细胞培养.pptVIP

第一页，共二十五页，2022年，8月28日 四大常用基本技术 逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR） 免疫组织化学技术（免疫组化） 免疫印迹技术（Western blot） 细胞培养技术 局限性 联合应用 第二页，共二十五页，2022年，8月28日 细胞培养技术 细胞培养（Cell culture）是指从生物体内取出组织或细胞，在体外适当的条件下，使之存活、生长和繁殖，并维持其结构和功能的方法。 细胞培养便于应用各种方法和技术进行研究，并可直接观察，已成为现代生物医学研究中一项非常重要的技术。 第三页，共二十五页，2022年，8月28日 培养细胞的生存条件 无菌环境（器皿、超净台） 超纯水 温度（37℃左右） 气体（5%CO2/空气） PH值（7.0-7.4，细胞耐酸不耐碱） 营养条件（基础培养基+10%FBS） 渗透压、培养基质等 第四页，共二十五页，2022年，8月28日 细胞培养用液 平衡盐溶液：洗涤组织、细胞 D-Hanks液、PBS液等。 消化液：分散细胞 0.25%胰酶、0.02%EDTA液或二者混合使用 培养液：细胞生存、生长和繁殖 基础培养基(DMEM、RPMI1640等），已商品化 10%左右的胎牛血清（FBS） 第五页，共二十五页，2022年，8月28日 培养细胞的来源 直接取材： 实验动物、胚胎、临床标本等 细胞系： 各实验室保存 细胞库：上海中科院细胞库、武汉细胞库、 中国医科院细胞中心 第六页，共二十五页，2022年，8月28日 培养方式 原代培养： 直接从生物体内获取组织细胞进行的首次培养。 只能原代培养：神经元、心肌细胞等。 传代培养： 当培养细胞增殖到一定密度后，生长受到抑制， 需要分散稀释后重新培养。 常见：肿瘤细胞系 第七页，共二十五页，2022年，8月28日 培养细胞的处理 改变细胞外部因素 改变细胞内部因素 第八页，共二十五页，2022年，8月28日 外部因素 药物 高温 低氧 射线 … 第九页，共二十五页，2022年，8月28日 内部因素 改变细胞内基因表达水平： 上调：基因转染 下调：RNAi 第十页，共二十五页，2022年，8月28日 细胞转染 转染（transfection）是指将外源性DNA或 RNA导入细胞的过程。 上调目的基因表达： 质粒载体 病毒载体 下调目的基因表达： 化学合成siRNA 质粒载体 病毒载体 第十一页，共二十五页，2022年，8月28日 转染方法 电转法 脂质体介导的转染法 病毒载体介导的转染法 … 第十二页，共二十五页，2022年，8月28日 转染试剂 脂质体与非脂质体：商品化，多家公司如Invitrogen、Fermentas、Qiagen等都有售。 常用： Invitrogen公司Lipofectamine 2000 可用来转染质粒和siRNA. 其他专用试剂：如Invitrogen公司RNAiMAX Transfection Reagent 专门用来转染siRNA. 第十三页，共二十五页，2022年，8月28日 瞬时转染与稳定转染 瞬时转染：将DNA导入活细胞内，但DNA不会嵌入细胞的染色体中，可在2-3天内收集被转染的细胞进行基因表达分析。 稳定转染：将目的基因导入活细胞，根据选择标记经过一段时间的筛选，使目的基因整合入细胞染色体中，从而得到稳定表达目的基因的细胞系。 第十四页，共二十五页，2022年，8月28日 真核筛选标记 第十五页，共二十五页，2022年，8月28日 设立对照组 空载体对照：如PCDNA3、PEGFP-N1等。 Scrambled siRNA：将选中的siRNA序列打乱。作为阴性对照的scrambled siRNA应该与选中的siRNA序列有相同的核苷酸组成，并且与目的基因的mRNA没有明显的同源性。 第十六页，共二十五页，2022年，8月28日 细胞特性检测 活力：MTT实验 凋亡：TUNEL染色、流式细胞术等 增殖：BrdU掺入法、克隆形成实验 分化：形态学观察、分化标志物检测 致瘤性：体内成瘤实验 … 第十七页，共二十五页，2022年，8月28日 靶基因表达水平检测 RT-PCR Western blot 免疫组化 其他：基因芯片、流式细胞术等