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基因工程知识点超全 基因工程是通过体外DNA重组和转基因等技术，按照人们的愿望对生物进行严格的设计，赋予其新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程也被称为DNA重组技术。 基因工程的基本工具包括限制性核酸内切酶、DNA连接酶和基因进入受体细胞的载体。限制性核酸内切酶是一种特异性酶，主要存在于原核生物中，能够识别特定的核苷酸序列并在特定的切点上切割DNA分子。DNA连接酶则用于将限制酶切割下来的DNA片段拼接成DNA分子。载体是一种能够在受体细胞中复制并稳定保存的分子，具有限制酶切点和标记基因，用于将目的基因送入受体细胞并在其中进行复制。 限制酶的切割部位是磷酸二酯键，切割后产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。黏性末端是当限制酶在识别序列的中轴线两侧将DNA的两条链分别切开时产生的，而平末端则是当限制酶在识别序列的中轴线处切开时产生的。 DNA连接酶的作用是将限制酶切割下来的DNA片段拼接成DNA分子。有两种类型的DNA连接酶，它们都能连接磷酸二酯键。 载体是基因工程中的分子运输车，具备在受体细胞中复制并稳定保存的能力。最常用的载体是质粒，它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核之外的双链环状DNA分子，具有一个至多个限制酶切点和标记基因。质粒以外，还有其他载体如λ噬菌体的衍生物和动植物病毒。载体的作用是作为运载工具将目的基因送入受体细胞，并在其中进行大量复制。 限制酶是一类酶，而不是一种酶。 限制酶是一种蛋白质，它的活性受到适宜的理化条件的影响。高温、强酸或强碱都会使限制酶变性失活。 在切割目的基因和载体时，应使用相同的限制酶，以产生相同的黏性末端。 为了获取一个目的基因，需要使用限制酶进行两次切割，共产生4个黏性末端或平末端。 不同的DNA分子使用同一种限制酶切割时，产生的黏性末端是相同的。然而，同一个DNA分子使用不同的限制酶切割时，产生的黏性末端通常不相同。 限制酶的切割位点应该位于标记基因之外，以避免破坏标记基因，以便进行检测。 基因工程中的载体与细胞膜上的物质运输载体不同。基因工程中的载体是DNA分子，能够将目的基因导入受体细胞内。而膜载体是蛋白质，与细胞膜的通透性有关。 基因工程中有3种工具，但只有2种工具酶。 限制酶MunⅠ的识别序列及切割位点是-C↓AATTG-，限制酶EcoRⅠ的识别序列及切割位点是-G↓AATTC-。 在基因工程中，通常使用同种限制酶来获取目的基因和切割载体，以获得相同的黏性末端。然而，如果使用两种不同的限制酶切割后形成的黏性末端相同，目的基因和载体也可以通过DNA连接酶连接起来。 为了防止载体或目的基因的黏性末端自连接，可以使用不同的限制酶处理目的基因和载体，使目的基因两侧及载体上具有两个不同的黏性末端。 基因工程的操作步骤包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞以及目的基因的检测与鉴定。 获取目的基因的方法包括直接分离法和从基因文库中获取目的基因。 将含有某种生物不同基因的许多DNA短片段导入受体菌的群体中储存，每个受体菌分别含有这种生物的不同基因，这就是基因文库，包括基因组文库和cDNA文库。 从基因组中获取目的基因最常用的方法是“鸟枪法”。 人工合成法有两种：化学合成法和反转录法。化学合成法适用于片段较小、核苷酸序列已知的目的基因，直接利用DNA合成仪用化学方法合成，不需要模板。反转录法以RNA为模板，在逆转录酶作用下合成目的基因DNA（cDNA）。 利用PCR技术可以扩增目的基因。PCR技术是一种在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术，需要使用热稳定的DNA聚合酶。通过指数式扩增可以获取大量的目的基因，前提是要有一段已知目的基因的脱氧核苷酸序列，以便合成引物。 基因表达载体的构建是基因工程的核心。它的目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。 将目的基因导入受体细胞的过程称为转化，转化的关键是目的基因整合到受体细胞染色体基因组中。常用的方法有农杆菌转化法、显微注射技术、感受态细胞法等，具体方法根据受体细胞的类型不同而有所区别。 目的基因的检测与鉴定需要标记基因的作用，常见的标记基因有抗生素抗性基因和发光基因。受体细胞常用的有植物受精卵或体细胞、动物受精卵、微生物等。合成糖蛋白、有生物活性的胰岛素需要用真核生物酵母菌，而不用支原体。不能使用哺乳动物成熟的红细胞，因为它们无细胞核，无法合成蛋白质。 (3)基因表达载体的构建是基因工程中最核心、最关键的一步，需要在体外进行。在基因表达载体中，启动子(DNA片段)不等于起始密码子(RNA)，终止子(DNA片段)也不等于终止密码子(RNA)。 (4)目的基因与载体可以通过多种方式连接，例如目的基因-目的基因、目的基