平胃散对中焦湿阻icc细胞ldh和sdh活力的影响.docxVIP

平胃散对中焦湿阻icc细胞ldh和sdh活力的影响 通过西班牙科学家conald在1893年发现了营养成分细胞（icc）。主要以网络结构分布在独立神经末梢和平滑肌细胞之间的特殊间质细胞，被称为原始“间质元宝”或卡卡尔平均间质细胞。该细胞位于胃动力基本功能单位(basic function unit of gastric motility, UGM)的中心位置,对神经递质等生物活性物质影响平滑肌收缩起着居间调制作用,可自发激活产生并传播慢波(slow wave, SW)、参与胃肠壁内神经(ENS)信息向平滑肌的传送、信号整合,并最终引起平滑肌细胞(smooth muscle cells ,SMC)产生机械运动。许多研究提示,Cajal间质细胞与胃肠动力障碍性疾病关系密切。 1 材料和机器 1.1 实验动物中心 湿阻中焦动物模型及血清来源动物:SD大鼠30只,雌雄各半,体质量180～220 g,由成都中医药大学实验动物中心提供。合格证号:SCXK(川)2004-11,检疫后备用。Cajal间质细胞来源动物:昆明株小鼠,雌雄不拘,出生后15 d左右。由成都中医药大学实验动物研究中心提供。 1.2 血清因子及免疫 平胃散:苍术、厚朴、陈皮、炙甘草等量(g),以上药物均购自北京同仁堂成都分店。中药常规煎煮,再浓缩为含生药1 g·ml-1的药液,4℃冰箱保存备用。M199培养基(Gibco);SCF(Peprotech);Ⅱ型胶原酶(Gibco);胎牛血清;大鼠抗小鼠c-kit抗体(武汉博士德);羊抗大鼠FITC标记荧光抗体(Vector);封闭用羊血清(北京中杉金桥);Ficoll400(Pharmacia);LDH,SDH测定试剂盒(南京建成生物工程研究所,批号分别20080624);总蛋白Doumas法检测试剂盒(四川省迈克科技有限责任公司,批号 0208111)。 1.3 仪器、试药与仪器 相差倒置显微镜(Leica,090-35.008-000型,Germany),酶联免疫检测仪(BIO-RAD,Mdel550型,AMERICA),免疫荧光显微镜(Leica,DMIRE2),二氧化碳培养箱(SANYO,MCO-15A型,JAPAN)。 2 方法 2.1 阻碍动物模型的构建和动物血清的制备 2.1.1 动物分组及模型构建 SD大鼠30只,雌雄各半。随机分为正常组10只,湿阻动物模型20只。造模方法详见参考文献。造模成功后将造模动物随即分为2组:模型组10只,平胃散组10只。停止造模后,平胃散组ig平胃散(10 ml·kg-1),正常组和模型组ig 0.9N.S(10 ml·kg-1),1次/d,共7d。 2.1.2 血清动物 灌胃结束,股动脉取血, 离心,取上清,混匀。56℃,30 min灭活;过滤除菌,-20℃冰箱保存备用。 2.2 培训和icc评估 2.2.1 大鼠心肌组织的制备 小鼠禁食12 h后,在无菌条件下,取距离回盲部10 cm的小肠,放入培养皿,剥去小肠系膜和血管,用PBS (pH7.0)将小肠内容物冲洗干净后,纵行剖开小肠,剥去小肠黏膜层,PBS反复冲洗肌条3～4次,将肌条剪碎至1～2 mm3小块后放入小烧杯中,加入Ⅱ型胶原酶(1.3 mg·ml-1),37℃消化30 min.过200目筛网,将含细胞的滤液1 500 r·min-1离心3 min,去上清,加入用M199重悬沉淀,用吸管反复吹打约后,1 500 r·min-1离心3 min,去上清,再重悬细胞1次,细胞加在等体积Ficoll400梯度密度液上,3 000 r·min-1离心10 min,取液面交界细胞沉淀。用M199培养基将细胞密度调整至1×106个/ml,接种至6孔培养板,板中预先放置包被鼠尾胶原(2 ng/cm2)的盖玻片。放置培养箱,在37℃,5%CO2条件下培养。 2.2.2 免疫荧光鉴定 细胞稳定培养7 d后,进行免疫荧光检测以确定是否为ICC细胞。 2.3 icc细胞排列 2.3.1 动物血清的代际c+模型血清的细胞组细胞组化指标,c 原代ICC对照组(原代ICC细胞,未加入任何药物和血清)、原代ICC+正常血清组(原代ICC细胞加1次正常动物血清)、原代ICC+模型血清组(原代ICC细胞加1次模型动物血清)、原代ICC+平胃散血清组(原代ICC细胞加1次平胃散动物血清)。 2.3.2 模型动物血清 原代ICC对照组(原代ICC细胞,未加任何药物和血清)、原代ICC+模型血清+正常血清组(原代ICC细胞先加湿阻模型动物血清,24 h后再加正常动物血清)、原代ICC+2次模型血清组(原代ICC细胞加2次湿阻模型动物血清,2次加血清时间间隔24 h)、原代ICC+模型血清+平胃散血清组(原代ICC细胞先加湿阻模型动物血清