紫鸭跖草CpBURP的克隆、表达及生物信息学分析.docx

? ? 紫鸭跖草CpBURP的克隆、表达及生物信息学分析 ? ? 彭国颖 卢山 黄超 杨坤 万玮 黄长干 （1. 江西农业大学/南昌市植物资源化学利用重点实验室，南昌 330045；2. 江西农业大学校友办，南昌 330045） 重金属污染日益成为影响农作物产量的重要因素，铜作为重金属污染物之一，在污染土壤时具有毒性和高持久性，而植物修复技术［1］是一种很有潜力、且环保的清除环境污染的绿色技术，通过超积累植物吸收污染物来达到修复土壤、水及空气的目的。目前，国内外研究较多的超积累植物有东南景天（Sedum alfredii）［2］、蜈 蚣 草（Pteris vittata）［3］、蓝 遏 菜（Thlaspi arvens）［4］、印 度 芥 菜（Brassica juncea）［5］、车前草（Herba plantaginis）［6］等植物。紫鸭跖草（Commelina purpurea）是一种超积累铜植物［7］，其耐受铜离子的能力强于其他普通植物，在修复铜污染的土地具有一定的潜力。因此，从分子水平上研究紫鸭跖草的耐铜机制具有重要的意义。 BURP蛋白为植物特有蛋白，由一类具有相似的初级结构且含有BURP保守结构域的蛋白质［8］，在植物生长过程中，BURP蛋白不仅参与植物种子的生长发育，而且在植物抵抗非生物胁迫时也具有重要的作用［9］。BURP蛋白是由BNM2（小孢子蛋白）、USP（种子非储存蛋白）、RD22（脱水反应蛋白）和PG1β（多聚半乳糖醛酸酶同工酶）4种蛋白质共同组成［10］，甘蓝型油菜中的BNM2会参与甘蓝型油菜的小孢子的产生及发育［11］；蚕豆种子中的USP参与种子的发育，Vokkaliga等［12］发现拟南芥USP基因的异位表达会影响种子的生长发育；RD22的发现源于拟南芥的脱水反应蛋白，其是植物应在非生物胁迫中的重要蛋白。José等［13］发现大豆GmRD22蛋白的异源表达会提高水稻对盐胁迫的抗逆性，钟活权［14］研究表明拟南芥受铜胁迫后，通过上调AtRD22的表达而提高自身的抗胁迫能力；番茄PG1β通过调节果实成熟过程中果胶的溶解的程度参与到果胶代谢中［15］。 目前，还未有关于紫鸭跖草BURP基因的报道。本研究依据紫鸭跖草的全长转录组数据库，应用HMMER 3.0程序筛选出CpBURP，并克隆出CpBURP，通过运用生物信息学软件对CpBURP蛋白的理化性质、保守结构域、磷酸化位点、二/三级结构、信号肽、跨膜结构、亚细胞定位及对同源蛋白构建系统进化树等方面进行探究分析，并利用qRT-PCR分析在Cu2+胁迫下紫鸭跖草根、茎、叶中的CpBURP表达量，为后期紫鸭跖草的BURP基因的深入研究奠定基础。 1 材料与方法 1.1 材料 剪取紫鸭跖草的嫩茎，用5 g/L高锰酸钾溶液消毒后放进霍格兰氏营养液中培养，待培养30 d后，嫩根长成，分别在0、50、100和300 μmol/L Cu2+的霍格兰氏营养液中培养4 d，以各Cu2+营养液培养的紫鸭跖草根、茎、叶为试验材料，取样后迅速用液氮冷冻，-80℃保存备用。 以紫鸭跖草全长转录组数据作为筛选BURP基因的数据库。 1.2 方法 1.2.1 基因的筛选与克隆 从Pfma数据库中下载BURP基因家族保守结构域的隐马尔可夫模型（Pfam：PF03181），运用HMMER 3.0程序在紫鸭跖草的蛋白质数据库进行搜索筛选出一个基因，再利用SMART确定其编码的蛋白具有BURP结构域，利用NCBI确定其具有完整的开放阅读框，将该基因命名为CpBURP。 采取Trizol法提取紫鸭跖草的总RNA，以反转录的cDNA为模板，依据转录组数据设计CpBURP引物（CpBURP-F：5-AACCCCTTCACTGCAAAGGC-3，CpBURP-R：5-ATCCGCGACGGTCCATGT-3），进行基因PCR扩增。用1.5%琼脂糖凝胶检测、回收，将目的基因与载体pMDTM19-T连接，转入大肠杆菌感受态细胞DH5α，筛选阳性克隆进行菌液扩增并测序（普洛麦格克公司）。 1.2.2 CpBURP的生物信息学分析 运用Expasy在线软件分析蛋白质的理化性质；运用MotifSearch在线软件分析蛋白质的保守结构域；运用NetPhos 3.1 Server在线软件分析蛋白质的磷酸化位点；运用Prabi在线软分析蛋白质的二级结构；运用SWISSMODEL在线软件分析蛋白质的三级结构；运用TMHMM在线软件分析蛋白质的信号肽；运用SignalP 4.1 Server在线软件分析蛋白质的跨膜结构域；运用PSOR在线软件分析蛋白质的亚细胞定位；在NCBI中检索拟南芥、苹果（Malus domestica）、黄瓜（Cucumis sativus）、香瓜（Cucumis melo）、野大豆