实验报告 猪血中超氧化物歧化酶.docVIP

PAGE PAGE 1 实验三 猪血中超氧化物歧化酶(SOD)的分离纯化及活力测定 实验原理 超氧化物歧化酶(SOD)是一种能够专一性清除超氧离子自由基的金属酶。它是一种酸性蛋白，对热、pH和蛋白酶的水解较一般酶稳定。SOD催化下述反应：.。机体内过量或不足都会对人体产生危害，SOD对过量的及时清除保证含量的相对平衡。 本实验采用有机溶剂沉淀法以新鲜猪血为材料，从中提取SOD并进行纯化。该实验SOD酶活性采用邻苯三酚自氧化法测定，其酶活性单位定义为：每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%酶量定义一个酶单位。 样品中蛋白质含量采用考马斯亮蓝法测定。考马斯亮蓝在游离状态下呈粉红色，与蛋白质结合后呈蓝色。在一定范围内，溶液在595nm波长下的光密度与蛋白质含量成正比，可用比色法测定，测定范围是1-1000ug。 SOD同工酶鉴定采用不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳技术分离鉴定。 二、试剂与材料 [1]试剂：ACD抗凝剂、0.9%、丙酮、05%乙醇、氯仿、50mmol/L pH8.3磷酸缓冲液、10mmol/LEDTA钠盐溶液、3 mmol/L邻苯三酚钠溶液、考马斯亮蓝标准蛋白质溶液、 [2]器材：分光光度计、试管、刻度吸管、离心机、烧杯。 三、操作步骤 1、SOD提取 [1] 取40ml新鲜猪血，5000r/m离心10min，去上层血浆，取下层红血球粘稠液。加入2倍体积的0.9%Nacl 溶液清洗，5000r/m离心10min，弃上层清液。 [2] 向洗净的红血球中加入适量蒸馏水至15ml，剧烈搅拌30min，使其充分溶血。再向溶血溶液中缓慢加入预冷的0.25倍体积的95%的乙醇溶液和0.15倍体积的氯仿，均浆呈红色，再继续搅拌15min，4000r/m离心10min，去变性蛋白质沉淀物，得上层液，留样1ml。将清液在65-70度恒温水浴中进行热处理，15min后取出迅速冷却至室温，5000r/m离心10min除沉淀，得浅黄色粗酶液，留样1ml。 [3] 向粗酶液中加入等体积的丙酮溶液，冰箱中静置过夜，4000r/m离心10min，弃上清液，得沉淀，加3ml蒸馏水溶解，备用。 2、SOD活力测定 [1] 邻苯三酚自氧化法测定 取4.5ml 50mmol/L pH8.3磷酸缓冲液，4.2ml蒸馏水和1ml 10mmol/L EDTA-Na2溶液，混匀后在25℃水浴中20min，取出后立即加入25℃预热过的邻苯三酚0.3ml，迅速摇匀，倒入1cm的比色皿，用10mmol/LHCl作空白，在325nm波长下每隔30秒测定一次光密度值，整个操作在4min内完成，计算出每分钟A325的增值，此即为邻苯三酚自氧化率。要求自化率在0.070/min左右。 [2]酶活力测定 操作与[1]类似，只是在加入邻苯三酚前需加入适量的SOD留样液，并相应减少蒸馏水的体积。计算加酶后邻苯三酚的自化率。 [3] 酶活力单位计算 其中：A0为邻苯三酚自化率，Am为加酶后邻苯三酚自化率。 [4] 蛋白质含量测定（考马斯亮蓝G-250法） ①标准曲线制作。取6支具塞试管，编号，按下表加入试剂： 表1 考马斯亮蓝标准曲线加样表 试剂 管号 1.0 2 3 4 5 6 蛋白质标准液(ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水(ml) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 考马斯亮G-250(ml) 5 5 5 5 5 5 蛋白质含量(ug) 0 20 40 60 80 100 盖上塞子，摇匀。在595nm下测定吸光度值，须在1h内完成。以标准白蛋白为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。 ②样品中蛋白质含量的测定 将待测溶液SOD溶解，取一支试管，准确加入0.1ml样品提取液，加入0.9ml蒸馏水和5ml考马斯亮蓝G-250，其余操作与标准曲线绘制相同。 ③蛋白质含量的测定 根据所得样品提取液的光密度，在标准曲线上查得相应的蛋白质含量，计算其浓度。 [5] 结果处理 利用考马斯亮蓝G-250法测定每毫升酶原液蛋白质毫克数。 四、实验结果 1、邻苯三酚自氧化率 表2 邻苯三酚吸光值随时间的变化 重复数 吸光值 0 0.5min 1min 1.5min 2min 2.5min 3min 3.5min 4min = 1 \* ROMAN I 0.031 0.065 0.102 0.137 0.170 0.202 0.233 0.262 0.291 = 2 \* ROMAN II 0.035 0.073 0.109 0.143 0.178 0.210 0.240 0.271 0.300 计算得邻苯三酚自氧化率：A0 = 1 \* ROMAN I=0.065/min，A0 = 2 \* ROMAN II=0.066/min；