3种免疫原对海湾链球菌强毒株nef832免疫效果的比较.docx

3种免疫原对海湾链球菌强毒株nef832免疫效果的比较 首先，跳跃海豚是总督的特征。这是由四种情况引起的人畜共患细菌病的病原体。革兰氏阳性感染各种水生动物，如象牙、罗非鱼、鲶鱼和箭头，对水产养殖产生了严重影响。因此,开发安全高效的疫苗以实现链球菌病的有效防治是当前研究的重点和热点。目前,国内外已报道多种形式的海豚链球菌疫苗,如福尔马林灭活全菌(FKC)疫苗,胞外产物(ECPs)、类M蛋白亚单位疫苗,混合组分的疫苗(FKC+ECPs),菌蜕疫苗,弱毒或减毒活菌疫苗,DNA疫苗等。其中,FKC制备方便、成本低廉,常被选作疫苗成分,但其免疫保护力不理想且交叉保护效果差,使其应用受限;FKC+ECPs成分的疫苗则能够有效辅助罗非鱼、牙鲆抵抗免疫原来源菌株及非免疫原来源菌株的侵袭。然而,针对不同免疫原所引起的鱼体免疫应答差异的研究较少,尤其缺乏对非特异性免疫的关注。鱼类是较低等的脊椎动物,其特异性免疫机制还很不完善,多数硬骨鱼类体内只有1类免疫球蛋白IgM,且其抗体形成周期长、抗体滴度不高,因此非特异性免疫在鱼类的免疫防御中发挥着重要作用。对鱼体非特异性免疫应答的研究可辅助评价免疫原的免疫效果,有助于对不同免疫原作用机制的了解。 本文选用牙鲆为实验动物,测定了血细胞吞噬能力及血清中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和酸性磷酸酶(ACP)的活力变化,对海豚链球菌强毒株NUF849来源的3种免疫原(FKC、ECPs及FKC+ECPs)产生的影响进行比较分析,以期为筛选链球菌疫苗有效成分,深入了解牙鲆针对不同免疫原所产生的非特异性免疫应答机制提供参考。 1 材料和方法 1.1 菌株和培养基 健康牙鲆购自日照某养殖场,体质量为(20±5)g,蓄养于40 cm×40 cm×70 cm水槽内,水温为(23±1)℃,不间断充气,日换水2/3,日投喂1%鱼体质量的商品化饲料。无菌取内脏组织平板划线、尾静脉取血进行抗体检查,暂养7 d证实牙鲆无病原感染后用于实验。 海豚链球菌NUF849、NUF812由Nagasaki University惠赠。经预实验测定,菌株NUF849和NUF812对实验牙鲆的半数致死量(LD50)分别为3.7×105CFU·mL-1和1.0×106CFU·mL-1,均具较强毒力。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)由本室保存。 培养基为哥伦比亚血平板(海博),脑心浸液(BHI)(Difco),普通营养琼脂(奥博星)。酶活试剂盒购于南京建成生物工程研究所,其他试剂均购于上海生工。 1.2 培养政策及菌株 海豚链球菌NUF849和NUF812经血平板28 ℃活化24 h,转接于BHI平板富集培养,以0.01 mol·L-1无菌磷酸盐缓冲液(PBS,pH=7.4)洗脱,离心(3 000 r/min,15 min,4 ℃),弃上清,重复洗涤3次收集菌体,用于疫苗制备及攻毒。金黄色葡萄球菌以普通营养琼脂培养,同法洗涤备用。 以平板玻璃纸法制备海豚链球菌胞外产物。活化后菌株接种于BHI肉汤,28 ℃静置培养24 h;取1 mL培养物涂布于预先铺覆1层灭菌玻璃纸的BHI平板(直径15 cm),28 ℃培养60 h;无菌PBS洗下菌苔,收集菌悬液离心(8 000 r/min,20 min,4 ℃);上清经0.22 μm微孔滤膜除菌,超纯水4 ℃透析后冻干,以PBS重悬,考马斯亮蓝法测定蛋白浓度后,分装贮存于-20 ℃备用。 1.3 微生物菌样制备 经麦氏比浊仪(BioMérieux)测定菌液浓度,以无菌PBS调整至109CFU·mL-1,加入福尔马林使终浓度为0.4%,37 ℃振摇灭活48 h。PBS洗涤细菌以去除福尔马林。涂布平板检测无活菌后,4 ℃备用。制备的FKC(108CFU)、ECPs(30 μg)、FKC+ECPs(FKC 108CFU+ECPs 30 μg)分别与弗氏完全佐剂等体积混合(见表1),每种免疫原注射5尾牙鲆,正常饲养观察7 d以检测其安全性。7 d后受试鱼均健康存活,表明免疫原安全性良好。 1.4 相对免疫保护率 设3个免疫组与PBS对照组(见表1),每组牙鲆150尾,分别腹腔注射FKC、 ECPs、FKC+ECPs 3种免疫原与PBS,并以红霉素软膏涂抹入针处。在免疫后第42天,每组随机取鱼80尾并平分为NUF849组和NUF812组,分别腹腔注射10倍LD50(NUF849:106CFU·mL-1,NUF812:107CFU·mL-1)的菌液0.1 mL进行攻毒,然后将NUF849组和NUF812组再随机等分为观察组与取样组(见表2),养殖条件同1.1,观察21 d,及时清除死亡鱼并统计死亡情况,按下列公式计算相对免疫保护率(RPS): RPS(%)=(对照组死亡率-免疫组死亡