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中药曲剂中有益菌及对脾虚小鼠肠道菌群的影响 研究以及有助于细胞菌和其他疾病的药物的开发和治疗是微生态学的一项重要任务。食物和动植物药物是研究有益菌和促进有益菌生长物质的重要对象。神曲是由几种食物和中药制成的传统发酵类中药, 酵母菌为其主要发酵菌, 补益中药也常作为神曲配方的重要成分。神曲是健脾消导类的一种常用中药, 广泛用于治疗消化系统疾病, 但对其治疗作用的生物学机制尚未见报导。本文拟从微生态学的角度, 对其有益菌、神曲不同配方对脾虚小鼠肠道菌群调整及肠保护作用进行研究, 以探讨其治疗作用的机制。 1 材料和方法 1.1 材料表面 1.1.1 实验动物 1～1.5月龄昆明种雄性小白鼠, 体重18～20g。 1.1.2 培养基和培养方法 神曲中微生物检测培养基 (MRS培养基、芽孢杆菌分离培养基、豆芽汁葡萄糖培养基、马铃薯葡萄糖培养基、肉膏蛋白胨培养基) , 肠道菌群检测培养基 (EC、EMB、LBS、BS和 BDB培养基) , 0.05﹪灭菌酵母粉水溶液作为肠菌群检测稀释液。 1.1.3 试剂 酵母样真菌同化试验编码鉴定管、细菌生化微量鉴定管 (杭州天和微生物试剂有限公司) 。其它药品均为分析纯。 1.1.4 丽珠肠乐集团 大黄等中药 (北京同仁堂药店) , 神曲 (北京同仁堂药店和其它药店) , 丽珠肠乐 (丽珠医药集团股份有限公司) 。大黄水煎剂 (含生药0.1g /mL) , 神曲 (北京同仁堂) 水煎剂 (含生药0.5g /mL) , 丽珠肠乐生理盐水稀释剂 (含0.2亿活菌/mL) 。 1.1.5 发酵培养带发酵的带树l 神曲中分离鉴定的酵母菌作为液态发酵神曲的单一菌种, 按配方制成液态发酵神曲1号和神曲2号。神曲1号制剂不含补益中药, 神曲2号制剂含补益中药。 1.2 方法 1.2.1 患者两种培养方法培养患者的培养 取6个不同来源的神曲样本, 分别研磨制粉, 各取1g, 加灭菌蒸馏水做10-2、10-3、10-4、10-5、10-6梯度稀释, 各取0.2mL稀释液分别接种于神曲微生物检测培养基中, 常规培养18～72h, 厌氧菌培养用GasPak法。计数菌落换算微生物数量, 筛选不同的菌落进行纯培养并根据菌落特征、细菌形态、革兰氏染色和生化特征鉴定微生物的种类。 1.2.2 大鼠的分组与治疗 参照文献方法, 大黄水煎液小鼠灌胃, 每天1次, 每次0.3mL, 连续8d造成小鼠脾虚模型。小鼠按体重随机分组, 正常对照组 (A组, 21只) , 脾虚小鼠分成5组 (每组16只) , 即脾虚自然恢复组 (B组) , 神曲治疗组 (C组) , 丽珠肠乐治疗组 (D组) , 神曲1号治疗组 (E组) , 神曲2号治疗组 (F组) 。A组和B组给予生理盐水灌胃, 每次0.3mL, 每天1次。其它组给予各组制剂灌胃, 每次0.3mL, 每天1次。分组后当日即进行肠道菌群检测和治疗。 1.2.3 道菌群的检测 在分组后当日治疗前, 随机取A组和脾虚小鼠各6只, 进行肠道菌群检测和结肠组织病理学观察。在治疗第6天和第12天, 每组随机取小鼠6只, 再进行肠道菌群检测和结肠组织病理学观察。肠道菌群检测具体方法为, 收集被迫排出的粪便于带有玻璃珠的无菌小瓶内称重, 按标本重量加稀释液作10倍稀释, 200次/min充分震荡混合后进行10-3、10-5、10-6稀释。取此3个稀释液在每个肠菌检测培养基中各滴种3滴, 每滴20微升。结肠内容物也作同样稀释和滴种。接种后, 需氧菌置37℃培养18h～24h, 厌氧菌置厌氧罐中37℃培养24h～72h。根据计数平板培养物中菌落数, 计算出每克标本中的菌含量 (CFU/g标本) , CFU/g标本=50×稀释倍数×1/标本重量。结果均取常用对数值LgCFU/g, 方差分析 (F检验) 。 1.2.4 镜标本的制作 在取结肠内容物的同时进行结肠组织大体病理学观察和组织取材。光镜标本常规取材, 固定, 切片, HE染色。电镜标本常规取材, 2.5%戊二醛4℃固定12 h, 锇酸固定1 h, 丙酮脱水, 树脂包埋, 修块, 切片, 铅铀染色。进行光镜和电镜观察。 2 结果 2.1 菌株有放线菌 从所购6个神曲样本中分离到多种微生物, 主要为细菌、真菌还有放线菌。在每克神曲中, 酵母菌含量在 (6～13) ×107, 杂菌含量在 (64～173) ×107, 杂菌种类在5～14种, 并在2分样本中分离到乳酸杆菌。 2.2 情感虚证,fd 在大黄水煎剂灌胃第3天, 小鼠出现便溏, 以后出现腹泻、纳呆、体重减轻、畏寒、活动减少, 四肢无力、毛枯槁等脾虚症状, 并逐渐加重。在分组第1天, 于治疗前肠道菌群检测结果:与正常对照组比较, 脾虚小鼠粪便与结肠内容物的肠杆菌、肠球菌数量显著增多, 乳酸杆菌、双歧杆