10例肝癌组织切片免疫组化诱捕受体3和unel的检测.docxVIP

10例肝癌组织切片免疫组化诱捕受体3和unel的检测 此外，还对dna开口进行了标记符号（tunel），以直接检测细胞的死亡。诱捕受体3 (DcR3) 是新近发现的肿瘤坏死因子受体超家族 (TNFR) 的新成员, 是一类可以和LIGHT、FasL、TL1A特异性结合的受体蛋白分子, 能竞争性抑制这些受体蛋白分子与死亡受体的结合, 从而阻断细胞凋亡过程。我们在同一肝癌 (HCC) 组织切片上进行了TUNEL和免疫组化DcR3染色, 同时定位观察凋亡细胞和DcR3表达情况, 为研究DcR3在HCC组织中的表达与细胞凋亡的关系寻找一种最佳方法。 1 免疫组化dc服刑人员染色 广西医科大学第一附属医院2004年1月～2005年2月手术切除的HCC组织标本10例份, 已行甲醛固定、石蜡包埋。10例HCC组织各4 μm厚切片4张, 其中1张单行TUNEL, 1张单行免疫组化DcR3染色 (EnVision 法) , 1张先行免疫组化DcR3染色再行TUNEL, 1张先行TUNEL再行免疫组化DcR3染色。TUNEL及免疫组化DcR3染色均按试剂盒说明书进行。免疫组化 DcR3染色结果判定标准:凡细胞质中出现明显的棕红色颗粒者为阳性细胞, 阳性细胞25%为0分、25%～50%为1分、51%～75%为2分、75%为3分;按切片中细胞有无染色及染色深浅记分, 细胞无染色为0分、浅棕红色为1分、棕红色为2分、鲜红色为3分;将上述两分相加, 得分2分为 (-) 、2～3分为 (+) 、4～5分为 (++) 、≥6分为 (+++) , (+) 、 (++) 、 (+++) 均判断为阳性。TUNEL结果判断标准:TUNEL标记的凋亡细胞为蓝黑色, 根据蓝黑色细胞的形态学特征 (如染色质浓缩、细胞皱缩与周围分离、出现凋亡小体、无明显炎症反应等) 进行综合判定, 每例选择10个以上高倍视野, DMR+Q550病理图像分析仪计数至少1 000个癌细胞及其中的凋亡细胞, 计算凋亡指数 (AI) , AI=凋亡细胞/1 000。采用SPSS13.0统计软件, 计量资料行样本均数t检验, 计数资料用χ2检验,P≤0.05为差异有统计学意义。 2 免疫组化dcra染色切片中表达凋亡细胞和表达dcear的关系 TUNEL标记的凋亡细胞为蓝黑色 (BCIP/NBT显色) , 定位于细胞核, 散在分布;免疫组化DcR3阳性细胞为细胞质中出现鲜红色 (AEC显色) 或棕黄色 (DAB显色) 颗粒, 呈弥漫性、小巢状或散在分布。10例HCC标本中, 单行TUNEL的切片中9例可见凋亡细胞 (AI为0.78±0.64) , 单行免疫组化DcR3染色的切片中8例阳性, 先行免疫组化DcR3染色再行TUNEL或先行TUNEL再行免疫组化DcR3染色的切片中也均有9例可见凋亡细胞、8例免疫组化DcR3染色阳性 (凋亡信号呈现于细胞核, DcR3表达于胞质) 。同1例HCC组织切片用不同的检测方法得到了相同的检测结果 (在同1张HCC组织切片上进行TUNEL及免疫组化DcR3染色后, 可见定位于细胞核的蓝黑色产物及定位于细胞质的鲜红色或棕黄色产物, 对比较鲜明, 易于辨认) , 未见同一细胞既为凋亡细胞又表达DcR3者。先行TUNEL再行DcR3免疫组化染色的切片, 两种阳性物质均清晰可见;先行DcR3免疫组化染色再行TUNEL的切片, 凋亡细胞的蓝黑色信号比单行TUNEL及先行TUNEL再行DcR3免疫组化染色者明显减弱, 而且之前的免疫组化阳性信号也有所减淡。 3 免疫组化染色 细胞凋亡是真核细胞常见的死亡形式。凋亡细胞在胞核和胞质结构上常出现特征性改变, 如质膜的快速突起发泡和钙依赖性核酸内切酶激活引起的DNA断裂和细胞核的解体及凋亡小体形成。有关凋亡细胞的检测方法较多, 如一般形态学检测法、透射电镜检测法、TUNEL法、DNA Ladder测定法和流式细胞术等。 TUNEL是一种快速和便捷的检测凋亡细胞的手段, 其基本原理是脱氧核糖核酸末端转移酶 (TdT) 以非模板依赖方式催化DNA游离3′-羟基末端核苷酸多聚化, 使标有的荧光素核苷酸掺入其中, 通过抗荧光素的抗体检测掺入的荧光素, 可在荧光显微镜下观测。因而在细胞凋亡研究中常应用TUNEL。本研究将TUNEL及免疫组化DcR3染色法有机结合在一起, 前者为碱性磷酸酶显色 (经BCIP/NBT显色后为蓝黑色) , 后者为辣根过氧化物酶显色 (经AEC或DAB显色为鲜红色或棕黄色) , 两者之间干扰小, 能在同一切片中展示凋亡细胞与相关凋亡基因的关系。这为细胞凋亡的研究开辟了一条新的途径, 该方法可用于DcR3在各种肿瘤组织中的表达与细胞凋亡的研究中。 在本研究中, 分别将免疫组化DcR3染色和TUNEL作为第一染色, 结果