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不同加工工艺对梅花松茸活性多肽的影响 鹿毛是一种古老的中国中药。它含有多种生理活性物质，可以促进生长发育和身体体力的发育。国内外专家学者对鹿茸进行了大量研究。传统的热加工提取方法使鹿茸中的热敏感性活性组分损失较大,因此,寻找一种新的鹿茸有效成分的提取方法,将会大大提高鹿茸多肽的提取效率,既节约原材料,又可以保证提取物的高活性。 本研究以不同加工方法处理的鹿茸为原料,采用分子排阻层析和离子交换层析的方法提取鹿茸多肽,建立了高效的提取方法,并对提取效果好的产品的免疫功效进行了初步研究,为进一步开发和利用鹿茸奠定了基础。 材料和方法 1. 鲁克斯 梅花鹿二杠鲜茸,由中国农业科学院特产研究所鹿茸试验基地提供。 2. 试验动物 SPF BALB/c小鼠,8～10周龄,购自哈尔滨兽医研究所。 3. 培养基和试剂 Sephadex G-50和CM-Sepharose Fast Flow 购自Pharmacia Biotch公司;牛血清白蛋白和MTT购自Sigma公司;蛋白质相对分子质量标准购自中国科学院上海应用化学研究所;其他试剂(均为分析纯)均购自北京化工厂;90-型磁力搅拌器为上海沪西分析仪器厂产品;LB-20切片机为上海科迪仪器有限公司产品;胶体磨为温州轻工设备厂产品;ER-52旋转蒸发仪为上海亚荣生化仪器厂产品;HD-3紫外检测仪和DBS-20M电脑部分收集器为上海沪西分析仪器厂产品。 4. 鹿加工 以不同的加工工艺处理鹿茸。 4.1 冻干、、加工 鹿茸留血密封后冷藏运输2 h以内,置-80℃冷冻保存,转入冷冻干燥机内进行冻干加工,制成冻干茸。冻干茸在实验室内低温快速粉碎,分装,置-20℃保存。 4.2 冷冻保存 鹿茸留血密封后冷藏运输2 h以内,置-80℃冷冻保存。用球磨粉碎机粉碎,加入无菌蒸馏水配制的60%乙醇,经胶体磨研磨成匀浆,冷冻干燥制成茸粉,分装,置-20℃保存。 4.3 热爆跑 鹿茸留血经传统热加工(煮炸、浇炸、烘烤、风干和干燥等)处理,低温快速粉碎,分装,置-20℃保存。 5. 制备牡丹花松茸的制备 分别称取冻干鹿茸粉、冷冻鲜茸和热炸茸粉各200 g,用蒸馏水冲洗至无血色后,各加入3 000 ml预冷的200 μmol/L pH 3.5的醋酸-醋酸钠缓冲溶液,用胶体磨匀浆,匀浆过程中不断添加预冷的pH 3.5的醋酸-醋酸钠缓冲溶液2 000 ml。将所得的匀浆液于层析柜内放置过夜,7 000 g离心15 min,取上清液,加入无水乙醇至终浓度为60%,4℃层析柜内放置,每20～30 min搅拌一次,4 h后7 000 g离心15 min,将上清液置50℃水浴中,真空旋转蒸发回收乙醇,最终浓缩体积约为500 ml,将其冻干,得梅花鹿鹿茸粗提物,-18℃保存备用。以上操作除减压回收乙醇外,均在4℃低温条件下进行。 6. 冷却、干燥、称重 分别称取冻干鹿茸粉、冷冻鲜茸和热炸茸粗提物各10 g,平铺于干燥至恒重的扁形称量瓶中,厚度不超过5 mm,精密称量。打开瓶盖,于100～105℃干燥5 h,将瓶盖盖好,移置干燥器中,冷却30 min,精密称量重量。再于100～105℃干燥1 h,冷却,称重,至连续2次称重的差异不超过5 mg为止。根据减失的重量,计算各样品中的水分含量。 7. 蛋白浓度测定 采用Lowry法。以牛血清白蛋白为标准品,精密定容,梯度稀释,在270 nm处测吸光度值,绘制标准曲线,由标准曲线求得各样品蛋白浓度。 8. 纯度试验 采用SDS系统检测粗提产物的纯度。 9. 去离子水平衡层析柱的安装 称取10 g Sephadex G-50,分别浸泡在200 ml重蒸水中,充分溶胀,倾去漂浮的细颗粒,再将Sephadex G-50分装入处理好的层析柱,用5倍柱体积以上的去离子水平衡层析柱。取上述粗提物含量高的冻干鹿茸的冻干品1.0 g,溶解于5 ml去离子水中,用0.45 μm膜过滤除去杂质,将样品加入柱内(上样量为150 mg/ml, 5 ml ),用去离子水洗脱,洗脱液流速1.0 ml/min,紫外检测仪280 nm检测活性峰,部分收集器收集活性峰处液体,-18℃分别保存备用,MTT法检测多肽活性,Lowry法检测蛋白含量。 10. 洗脱和活性检测 分别取活性峰收集液100 ml,以醋酸-醋酸钠缓冲溶液调整pH值和离子强度至pH值3.5,以CM-Sepharose Fast Flow为介质装填层析柱,层析柱充分平衡后,以1.5 ml/min流速将样品注入柱内,加样后以10 ml/min流速,分别用5 mmol/L pH 3.5醋酸-醋酸钠缓冲溶液和0.5 mol/L pH 4.0醋酸-醋酸钠缓冲溶液洗脱,紫外检测仪280 nm检测活性峰,部分收集器收集活性峰,透析除盐冻干,-18℃保存备用,MTT法检测多肽活