三维多孔聚乳酸聚羟乙酸共聚物plga及plurenic-f.docx

三维多孔聚乳酸聚羟乙酸共聚物plga及plurenic-f 0 新型骨软骨复合组织的构建 关节软骨缺乏有效的分离和生长能力，损伤后的修复能力有限。组织技术的发展为解决这个问题提出了新思路。利用该技术已成功地构建了皮肤、肌腱等组织,并有相应的产品应用到临床。 单纯组织工程软骨修复关节骨软骨缺损时,移植体与移植床的愈合界面是软骨-软骨、软骨-骨界面的整合,而这两种界面的整合较慢,移植体在移植床表面不稳定,可能导致修复失败。因此,目前很多研究倾向于研究构建组织工程骨与软骨复合物,旨在修复软骨下骨缺损的同时,使移植体在缺损区的整合固定界面由软骨-骨变为骨-骨界面,从而加快界面的愈合。 国内王栋等研究证明骨髓基质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)经向软骨细胞定向分化后复合PLGA支架材料,通过紧密压配方式与MSCs-PLGA支架在体内构建骨软骨复合体,可以有效修复骨软骨缺损。Gao等将大鼠干细胞诱导成软骨细胞后接种于透明质酸海绵,诱导为成骨细胞后接种于多孔磷酸钙陶瓷,然后用纤维蛋白陶瓷将两者粘结在一起,于裸鼠皮下进行培养,结果显示构建出了骨软骨复合组织。但以上方法均存在构建组织的骨软骨界面结合不佳的问题。而关节骨和软骨的界面结合强度不足将难以满足关节载荷的要求。本实验以软骨细胞和成骨细胞为种子细胞,以三维多孔聚乳酸/聚羟乙酸共聚物(poly(lactide-co-glyco-lide),PLGA)、Pluronic-F127水凝胶分别作为骨和软骨支架材料,体外构建组织工程骨软骨复合物,观察其在体内异位成骨软骨作用,旨在探讨构建组织工程骨软骨复合物的可行性,以期修复较大面积骨软骨复合缺损。 1 免疫组织化学 设计:开放性实验。 单位:中山大学附属第二医院骨科。 材料:实验于2006-07/2007-04进行,细胞实验在中山大学附属第二医院医学研究中心实验室完成,动物实验在中山大学北校区实验动物中心完成。取2月龄新西兰大白兔,体质量不限,雌雄不限;SPF级4周龄裸鼠20只,体质量20 g左右,雌雄不限。所有动物均由中山大学北校区实验动物中心提供,许可证号SCXK2004-0011。实验过程中动物处置符合动物伦理学标准。 实验方法: 软骨细胞的培养:2月龄新西兰大白兔以速眠新1支肌注麻醉,仰卧位,膝关节内侧切口,髌骨外侧脱位,暴露股骨内外侧髁,无菌切取膝关节软骨,于洁净工作台上PBS缓冲液冲洗并剪成约1 mm3碎片,离心后先以0.25%的胰蛋白酶37℃消化30 min,用PBS液冲洗1次。加入0.2%的Ⅱ型胶原酶,置于37℃恒温下消化8h,细胞悬液离心后用PBS冲洗1次,加入低糖DMEM培养液(含体积分数为0.1的胎牛血清,青、链霉素各100 U/m L),调整细胞数目约2×108L-1接种于25 cm2无菌培养瓶,置于37℃、体积分数为0.05的CO2培养箱内进行原代培养原代细胞。贴壁后,隔日更换培养基。原代细胞80%融合为单层后,继续进行传代培养。培养的第2代细胞作细胞爬片,冷丙酮固定30 min,作II型胶原免疫组织化学染色。方法按免疫组织化学试剂盒说明操作进行。 成骨细胞的培养:2月龄新西兰大白兔麻醉后,无菌条件下切取其双下肢胫骨骨外膜,标本经洗涤、剪碎后于搅拌状态下在0.25%胰蛋白酶中消化30 min(37℃),再用0.1%胶原酶消化2 h(37℃),取上清液,离心收集细胞。加入高糖DMEM培养液(含体积分数为0.15的胎牛血清,,青、链霉素各100 U/m L),将获取的细胞悬液按2×108L-1细胞浓度接种到25 cm2培养瓶中进行原代细胞培养。 30%Pluronic F-127凝胶的配制:取3 g Pluronic F-127,分次缓慢加入盛有10 m L PBS的洁净玻璃瓶内,在4℃用振荡器持续振荡,直到白色絮状颗粒完全消失为止。经0.22μm滤膜过滤除菌后4℃保存备用。 PLGA支架的预处理:将PLGA支架材料加工成10 mm×6 mm×4 mm大小,用体积分数为0.75的乙醇处理48 h,三蒸水处理36 h洗去乙醇,去除三蒸水,在密闭环境中紫外线照射下干燥24 h。以0.1%多聚赖氨酸包被支架12 h,使用前泡入培养液中过夜预湿,常温干燥。 组织工程软骨的体外构建:选用生长状态良好的第3代软骨细胞,培养的软骨细胞经质量分数为0.25%的胰蛋白酶消化后,用PBS缓冲液冲洗,1 000 r/min离心5 min浓集。在4℃状态下将软骨细胞与PBS配制的Pluronic F-127混匀,制成细胞凝胶复合物,使软骨细胞终浓度为5×1010L-1。 组织工程骨的体外构建:将预处理的实验组PLGA支架置于24孔培养板中,每孔一块。选用生长状态良好的第4代成骨细胞,培养的成骨细胞经0.25%的胰蛋白