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鱼肉中大肠杆菌的分离与鉴定 实验报告 一、实验目的 1.学习大肠杆菌的鉴定方法。通过选取培养好的菌群，并通过PCR扩增以及凝胶成像技术鉴定大肠杆菌。 2.学习PCR的原理及技术 二、实验原理 1.大肠杆菌（E.coli)为埃希氏菌属（Escherichia)代表菌。一般多不致病，为人和动物肠道中的常居菌，在一定条件下可引起肠道外感染。某些血清型菌株的致病性强，引起腹泻，统称致病性大肠杆菌。 2.大肠杆菌（Escherichia coli,E.coli)革兰氏阴性短杆菌，大小0. 5x1-3微米。周生鞭毛，能运动，无芽孢。能发酵多种糖类产酸、产气是人和动物肠道中的正常栖居菌，婴儿出生后即随哺乳进入肠道，与人终身相伴，几乎占粪便干重的1/3.国家规定，每毫升饮用水中的菌落总数小于100,每100毫升水中不得检出总大肠菌群 3.PCR扩增技术是指在体外简化条件下模拟DNA体内复制的DNA快速扩增的方法。本实验通过大肠杆菌特定引物对菌种DNA进行PCR扩增，之后凝胶成像鉴定样品中的菌种是否是大肠杆菌。 三、实验流程 （1）超净工作台无菌操作 （2）灭菌 （3）麦康凯培养基的制备与灭菌 （4）培养皿的制备 （5）称量鱼肉 （6）均质 （7）梯度稀释 （8）涂培养皿 （9）挑取单菌落 （10）提取DNA（水煮法） （11）PCR扩增 （12）凝胶电泳 （13）紫外显影 实验方法 CTAB/NaCI法： 1、接种一单菌落于5mlLB中，30℃培养过夜。 2、取1ml种子培养液接入100ml2%LB中．37℃、220r/min培养16小时。 3、5000r/min离心10分钟，弃去上清。 4、加入10mITE离心洗涤后，用10mITE溶解菌体，混匀，－20℃保存备用。 5、取3. 5ml菌悬液，加入184μl10%SDS.混匀，加入37μl10mg/ml蛋白酶K.混匀，37℃温育1小时 6、加入740μl5mol/LNaCl,再加入512μICTAB/NaCl.混匀，65℃温育10分钟。 7、加入等体积的氯仿／异戊醇，混匀．10000r/min离心5分钟，保留上清。 8、上清中加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25:24:1)混匀．10000r/min离心5分钟，保留上清。 9、加入0. 6倍的异丙醇，混匀，10000r/min离心5分钟，收NA沉淀，用70%乙醇离心洗涤DNA沉淀。 10、用1mITE溶解DNA,加入终浓度为20μg/mlRNaseA.4℃保存。CTAB/NaCI法提取的DNA纯度较高，蛋白杂质较少，保存时间长，编者更喜欢把终浓度为20μg/ml RnaseA加在第5步温育的时候，这样最后没有RnaseA污染。每一步操作细致一些，得到的DNA可用于Southern blot.编者建议：长时间保存DNA可放于－20℃,但要尽量减少反复冻融，否则影响DNA质量。 五、实验步骤 （1）超净工作台无菌操作 1:打开超净台紫外灭菌灯开关。 2:关闭超净台紫外灭菌灯开关。 3:打开超净台荧光灯开关。 4:打开超净台风扇开关。 5:抬起玻璃门。 6:用75%酒精消毒。 7:夹取酒精棉。 8:擦拭超净台台面。 9:关闭超净台荧光灯。 10:关闭超净台风机。 （2）灭菌 1:打开电子天平开关。 2:将称量纸放于天平托盘上。 3:点击清零键。 4:取固体蛋白胨粉末。 5:放于称量纸上。 6:称量好的蛋白胨粉末放于500mL三角瓶中。 7:用200mL量筒量取200mL去离子水。 8:将去离子水倒入三角瓶中。 9:用50mL量筒量取25mL去离子水。 10:将去离子水倒入三角瓶中。 11:使用透气封口膜封住三角瓶。 12:灭菌胶带上标明试剂名称、组别和日期。 13:点击清零键清零。 14:取TSB粉末。 15:放于称量纸上。 16:称量好的TSB粉末放于300mL烧杯中。 17:用200mL量筒量取160mL去离子水。 18:将去离子水倒入烧杯中。 19:将烧杯放于电加热版上。 20:打开电加热板开关。 21:调节温度至100摄氏度。 22:点击Set开始升温。 23:关闭加热板。 24:取下烧杯。 25:确认5mL移液器量程为5mL。 26:移液枪吸取5mLTSB溶液。 27:TSB溶液放于试管1中。 28:移液枪再次吸取5mLTSB溶液。 29:TSB溶液放于试管1中。 30:扔掉枪头。 31:用灭菌胶带在试管架上注明信息。 32:取50mL去离子水。 33:将去离子水倒入50mL蓝盖试剂瓶中。 34:输入去离子水瓶信息。 35:将所用到的50mL烧杯等放入灭菌袋1中。 36:在灭菌袋上注明信息。 37:将所用到的涂布棒物品放入灭菌袋2中。 38:在灭菌袋上注明信息。 39:将所用到的枪头盒放入灭菌袋3中。 40:在灭菌袋上注明信息。 41:将所