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细菌的转化与基因改造 实验报告 一、实验目的 1.学习制备抗性平板； 2.通过特定质粒转化大肠杆菌，学习细菌转化的基本 原理及方法； 3.验证DNA是遗传物质，加深对中心法则的理解； 4. 制作荧光微生物画 二、实验原理 转化(transformation)是指受体细菌通过直接吸收来自供体细菌或人工重组的含有特定基因的DNA片段，从而获得了相应遗传性状，这种现象称为细菌转化 细菌转化的过程是DNA导入和表达的过程。受体菌的生理状态是影响转化率的首要因素。 实验室常用的转化细菌的方法分为化学性感受态菌转化和电打孔转化（又叫电击转化）。前者需要化学方法处理细菌制备感受态，最为常用；后者虽然受体菌容易制备，也容易获得高转化率，但需要电转化设备 三、实验仪器、材料 水浴锅、台式高速离心机（eppendorf 5418）、移液器一套、摇床、微波炉、超净工作台、载体质粒： pGEX-4T-1-EGFP（增强绿色荧光蛋白）、pGEX-4T-1-RFP（红色荧光蛋白）、灭菌的EP管、管架、无菌ddH2O、转化试剂盒、感受态DH5α细胞、LB培养基、amp母液100mg/ml、IPTG母液 四、实验步骤 （1） amp抗性+诱导LB平板的制备 1.紫外灯照射超净工作台30min；将 LB固体培养基用微波炉加热，期间取出摇匀几次，至培养基完全溶化； 2.超净台消毒结束，关闭紫外灯，打开照明灯和风机，抬升超净台前挡板约20cm高度，通风3min； 3.点燃酒精灯，酒精棉球消毒双手和台面，准好无菌培养皿； 4.待培养基不太烫手时，无菌操作加入amp母液，混匀，倒平板，每人2块；一块含amp，一块不含amp。 5.平板凝固后，在平板表面加适量IPTG溶液涂匀 （2）载体质粒转化感受态大肠杆菌（每人一份） 1.每2人一个小冰盒，取DH5α 感受态细胞1支（-80℃冰箱）,迅速插入冰中 5 min，待菌块刚融化，均分为2管，每管加入质粒3 μl, 用手拨打 EP 管底轻轻混匀，冰中静置 25 min。 2.42 ℃水浴热激 45 s，迅速放回冰上并静置 2 min（晃动会降低转化率）。加入 700 μl无抗生素 LB 液体培养基，混匀 37 ℃，200 rpm复苏 60 min。 3.5000 rpm离心 1 min 收集菌体，留 200 μl上清轻柔重悬菌块，并涂布到的2种 LB 平板（LB+ARB or IPTG、LB+amp+ARB or IPTG）上，每块100ul。平板倒置于 37 ℃ 培养箱过夜，第2天观察转化子。 五、实验预期结果 质粒转化DH5a pGEX-4T-1-EGFP转化大肠杆菌 pGEX-4T-1-EGFP转化大肠杆菌(蓝光灯下) 油镜下的GFP大肠杆菌 六、思考题 （1）选择性培养基是什么？如何使用选择性培养基？ 选择性培养基，是指根据某种（类）微生物特殊的营养要求或对某些特殊化学、物理因素的抗性而设计的，能选择性区分这种（类）微生物的培养基。利用选择性培养基，可使混合菌群中的某种（类）微生物变成优势种群，从而提高该种（类）微生物的筛选效率。例如，以纤维素为唯一碳源的培养基可用于筛选纤维素降解菌；无氮培养基只能供有固氮能力的菌生长，是固氮菌的选择性培养基；pH5.0?5.5的培养基有利于真菌的生长，而中性或微碱性的培养基对细菌和放线菌生长更有利；在培养基中加入特定的染料或抗生素抑制某些菌的生长，也可提高培养基的选择性，对于筛选菌种具有重要的实践意义。 ①尽量使用新鲜培养基，2～4h内用完；? ②应使用预还原培养基，预还原24～48h更好；? ③可采用预还原灭菌法制作的培养基（用前于培养基中加入还原剂，如L-半胱氨酸、硫乙醇酸钠、维生素C及葡萄糖等，尽可能使预还原剂处于还原状态）；? ④液体培养基应煮沸10min，以驱除溶解氧，并迅速冷却，立即接种医。学教育网搜集整理；? ⑤培养厌氧菌的培养基均应营养丰富，并加有还原剂与生长刺激因子（血清、维生素K、氯化血红素、聚山梨酯-80等）。? （2）野生型大肠杆菌可以做转化吗实验吗？为什么？ 可以。转化（transformation）是将一种生物（供体）的遗传物质（通常为DNA）转入另一种生物（受体）并使其在受体中得以保存和繁殖的过程。大肠杆菌不是天然感受菌，在低温（0~5℃）环境下经CaCl2处理，细胞壁变松变软后能摄入外源DNA，这种状态称为感受态细胞（competentcell）。经CaCl2处理后大肠杆菌与外源DNA混合进行42℃短时间的热激可利于外源DNA转化，然后再经过恢复和筛选，选择转化子。