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植物细胞骨架的光学显微镜观察 考马斯亮蓝R250染色法观察微丝 实验报告 一、实验目的 1.掌握观察植物内微丝的方法：考马克考马斯亮蓝R250染色法 2.通过对洋葱内皮细胞的处理掌握植物细胞骨架的制备方法 3.了解细胞细胞骨架基本形态。 二、实验原理 细胞骨架（cytoskeleton),是细胞内以蛋白质纤维为主要成分的网络结构，根据蛋白质纤维的直径、组成成分和组装结构的不同可分为微丝、微管和中等纤维。细胞骨架对于维持细胞的形态结构及细胞运动、物质运输、能量转换、信号传导和细胞分裂等有重要的作用。 观察和研究细胞骨架可用光镜、电镜、间接免疫荧光技术、细胞化学技术等方法。对光镜下细胞骨架的形态学观察，多用1%Triton X-100(聚乙二醇辛基苯醚）处理细胞，使95%以上的可溶性蛋白质及全部脂质被抽提，但细胞骨架系统的蛋白却被保存下来，固定后用蛋白质染料考马斯亮蓝R250染色，使胞质中微丝得以清晰显见。 三、材料与试剂 材料：洋葱 器材：显微镜、载玻片、滴管、擦镜纸、PH计 试剂： 1.0. 01mol/L磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）、0.2mol/L Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液（PB,PH7. 3)50ml、0. 15mol/L NaCl、加双蒸馏水加至1000ml； 2．PB 0. 2mol/L Na2HPO 77ml、40. 2mol/L NaH2PO4 23ml； 3．M-缓冲液 咪唑（PH 6. 7) 50mmol/L KCI 50mmol/L MgC12 0. 5mmol/L EGTA 1mmol/L EDTA 0. 1mmol/L 巯基乙醇 1mmol/L 甘油 4mmol/L 用1mol/L HCI调pH至7. 2. 4．1%的Triton X-100/M-缓冲液 5．0.2%考马斯亮蓝R250染液 甲醇 46. 5ml 冰醋酸 7ml 蒸馏水 46. 5ml 6．3%戊二醛－PB溶液（PH7. 2) 四、实验步骤 1、取洋葱内皮1cm左右，置于含PBS液的载玻片上 2、湿润后，吸去PBS 3、加2滴1%Triton X-100/M缓冲液，20min 4、吸去缓冲液，加3%戊二醛－PB溶液，固定30min 5、加PBS洗2次，共3min 6、加0. 2%考马斯亮蓝R250染色20min 7、用PBS洗2次，共2min,吸干 8、镜检并绘图 光镜下可见表皮细胞的轮廓，细胞内存在这个被染成蓝色、粗细不等的纤维网络结构，便是构成细胞骨架的微丝束，选择染色较好的细胞，转换高倍镜观察，若转动微调，可以见到细胞骨架的立体结构。 五、实验结果与思考题 1、画出实验所观察到的细胞骨架图，并注明放大倍数。 被考马斯亮蓝染液染成蓝色的细胞骨架 1.为什么用TritonX-100的缓冲液处理材料？ Triton X-100是一种非离子型去垢剂，是一种比较温和的去垢剂（表面活性剂或称界面活性剂），常作为添加剂使蛋白保持稳定，尤其是膜蛋白。Triton X-100可将细胞质膜中和细胞质中的全部脂质和部分蛋白质被溶解抽提,但细胞骨架蛋白质不受破坏而被保存。 注意事项 1、用去垢剂TritonX-100的缓冲液处理材料时，应控制在30min左右。 2、每一次加液或染色后，应用PBS洗2次，并用滤纸吸干。