细菌芽孢、荚膜和鞭毛染色.docxVIP

实验二 细菌芽孢、荚膜和鞭毛染色 实验报告 实验目的 1.学习并掌握芽胞染色法并了解芽胞的形态特征 2.学习并掌握荚膜染色法并了解荚膜的形态特征 3.学习并掌握鞭毛染色法并了解鞭毛的形态特征 4.巩固显微镜操作技术及无菌操作技术 实验原理 简单染色法适用于一般的微生物菌体染色，而某些微生物具有--些特殊结构，如芽胞、荚膜和鞭毛，对它们进行观察前需要进行有针对性的染色。 芽胞是芽胞杆菌属和梭菌属细菌生长到一定阶段形成的一种抗逆性很强的休眠体结构，也被称为内生孢子，通常为圆形或椭圆形。是否产生芽胞及芽胞的形状，着生部位，芽胞囊是否膨大等特征是细菌分类的重要指标。与正常细胞或菌体相比，芽胞壁厚，通透性低而不易着色，但是，芽胞-一旦着色就很难被脱色。利用这一特点，首先用着色能力强的染料(如孔雀绿或石炭酸复红)在加热条件下染色，使染料既可进入菌体也可进入芽胞，水洗脱色时菌体中的染料被洗脱，而芽胞中的染料仍然保留。再用对比度大的复染剂染色后，菌体染上复染剂颜色，而芽胞仍为原来的颜色，这样可将两者区别开来。 荚膜是包裹在某些细菌细胞外的--层黏液状或胶状物质，含水量很高，其他成分主要为多糖，多肽或糖蛋白等。荚膜不易着色且容易被水洗去，因此常用负染法进行染色，使背景着色，而荚膜不着色，在深色背景下呈现发亮区域。也可以采用Anthony氏染色法，首先用结晶紫初染，使细胞和荚膜都着色，随后用硫酸铜水溶液洗，由于荚膜对染料亲和力差而被脱色,硫酸铜还可以吸附在荚膜上使其呈现淡蓝色，从面与深紫色菌体区分。 鞭毛是细菌的纤细丝状运动“器官”。鞭毛的有无、数量及着生方式也是细菌分类的重要指标。鞭毛直径一般为10~ 30 nm，只有用电镜才能直接观察到。若要用普通光学显徼镜观察，必须使用鞭毛染色法。首先用媒染剂(如单宁酸或明矾钾)处理，使媒染剂附着在鞭毛上使其加粗，然后用碱性复红(Gray 氏染色法)碱性复品红(Leifson 氏染色法)，硝酸银(West 氏染色法)或结晶紫(Difco氏染色法)进行染色。 操作步骤 芽胞染色( Schaeffer - Fulton氏染色法) 制片：按常规方法涂片﹑干燥及固定 加热染色：向载玻片滴加数滴5%孔雀绿水溶液覆盖涂菌部位，用夹子夹住载玻片在微火上加热至染液冒蒸汽并维持5 min，加热时注意补兖染液，切勿让涂片干涸 脱色：待玻片冷却后，用缓流自来水冲洗至流出水无色为止 复染：用0.5%番红水溶液复染2 min 水洗：用缓流自来水冲洗至流出水无色为止 镜检：将载玻片晾干后油镜镜检 夹膜杂色 负染法： ①载玻片准备：用乙醇清洗载玻片，彻底去除油迹 ②制片：在载玻片一端滴一滴6%葡萄糖水溶液，无菌操作取少量菌体于其中混匀，再用接种环取一环绘图墨水于其中充分混匀。另取一块载玻片作为推片，将推片---端与混合液接触，轻轻左右移动使混合液沿推片散开，之后以约30℃角迅速向载玻片另一端推动，带动混合液在载玻片上铺成薄膜。 ③干燥：将载玻片在空气中自然干燥。 ④固定：滴加甲醇覆盖载玻片固定1 min后倾去甲醇。 ⑤干燥：将载玻片在空气中自然干燥。 ⑥染色：在载玻片上滴加1%甲基紫水溶液染色1 ~2 min。 ⑦水洗：用自来水缓慢冲洗,自然干燥。 ⑧镜检：用低倍镜和高倍镜镜检观察。 Anthony氏染色法： ①涂片：按常规方法取菌涂片。 ②固定：将载玻片在空气中自然干燥。 ③染色：用1%结晶紫水溶液覆盖涂菌区域染色2 min。 ④脱色：倾去结晶紫水溶液后，用20%硫酸铜水溶液冲洗，用吸水纸吸干残液，自然干燥。⑤镜检：用油镜镜检观察。 鞭毛染色： 硝酸银染色法： ①载被片准备：将载玻片置于含洗衣粉或洗涤剂的水中煮沸20 min，然后用清水充分洗净，再置于95%乙醇中浸泡，使用时取出在火焰上烧去乙醇及可能残留的油迹。 ②菌液制备：无菌操作用接种环由普通变形菌14~18 h牛肉膏蛋白陈半固体新鲜培养物平板上挑取数环菌落边缘菌体，悬浮于1 ~2 mL无菌水中制成轻度浑浊的菌悬液，不能剧烈振荡。 ③制片：取一滴菌悬液滴到洁净载玻片一端，倾斜玻片，使菌悬液缓慢流向另一端，用吸水纸吸去多余菌悬液，自然干燥。 ④染色：滴加硝酸银染液A液覆盖菌面3 ~ 5 min后用蒸馏水充分洗去A液。用硝酸银染液B液洗去残留水分后，再滴加B液覆盖菌面数秒至1 min，其间可用微火加热，当菌面出现明显褐色时，立即用蒸馏水冲洗，自然干燥。 ⑤镜检：用油镜镜检观察。 Leifson氏染色法： ①载玻片准备、菌液制备及制片方法同硝酸银染色法。 ②划区：用记号笔在载玻片反面将有菌区划分成4个区域。 ③染色：滴加Leifson 氏鞭毛染液覆盖第一区菌面，间隔数分钟后滴加染液覆盖第二区菌面，以此类推至第四区菌面。间隔时间根据实验摸索确定，其目的是确定最佳染色时间，一般染色时间大约