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水体中菌群总数和大肠杆菌的检测 实验报告 模块一：水体中微生物样品的采集、分离和细菌总数的测定 模块二：尚书水体中大肠杆菌菌群检测及生理生化测定 模块三：大肠杆菌的血清学检测 实验目的 1.1了解水质状况与细菌数量在饮水中的重要性 1.2学习并掌握各类水样采集和细菌活菌计数的方法 1.3了解平板菌落计数法在有关行业的微生物检验中的作用和意义。 2.1了解大肠菌群的检测在环境评估和食品质量监 测中的重要意义； 2.2掌握细菌在鉴定培养基的识别方法以及鉴定培 养基的选择原则； 2.3掌握大肠菌群最近似数的测定方法 3.1了解细胞凝集实验的原理 3.2学习并掌握大肠杆菌血清学检验的方法 实验原理 模块一： 1.平板活菌计数法 一个菌落代表一个单细胞，因此通过统计菌落数就可以计算出样品中含有的活菌数。菌落总数就是指在一定条件下（如需氧情况，营养条件，ph，培养温度和时间等）每克（每毫升）检样所生长出来的细菌菌落总数。 2.菌落总数检测技术 检样25克样品+225毫升稀释液，均质→10倍系列稀释→选择两个到三个适宜稀释度的样品匀液，各取1毫升分别加入无菌培养基中→每闵中加入15毫升到20毫升平板计数琼脂培养基混匀→培养→计数各个平板菌落数→计算菌落总数→报告。 模块二： 总大肠菌群： 总大肠菌群是指一群在37℃培养24h能发酵乳糖、 产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。 大肠菌群不是细菌学上的分类命名，而是卫生 领域用语。大肠菌群包括了大肠艾希氏菌、弗氏 柠檬酸杆菌、肺炎克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌等。 卫生学意义： 大肠菌群和大肠杆菌是评价卫生质量的重要指标，水中的病原菌主要来源于人和动物的传染性排泄物。水的 微生物学检验，特别是肠道细菌的检验，在保证饮用水 安全和控制传染病上有着重要意义，同时也是评价水质 状况的重要指标。 国家饮用水标准规定，饮用水中总大肠菌群、耐热大 肠菌群和大肠埃希氏菌不得检出，细菌总数每mL不超 过100个。 大肠菌群在肠道内数量最多，国际上公认大肠菌群是 粪便污染的指示菌。 标准检测方法： 生活饮用水及其水源水中微生 物指标检测需按《GB/T 5750. 12-2006 生活饮用水标准检测方 法-微生物指标》的程序和方法 检测。 食品中大肠菌群的计数按《GB 4789.3—2010 食品安全国家标 准 食品微生物学检验-大肠菌群 计数》 测定原理(多管发酵法) ：初步发酵试验→ 平板分离（伊红美蓝鉴别培养基） →革兰氏染色→ 复发酵试验 大肠杆菌测定—EMB选择性分离鉴别 伊红和美蓝可抑制G+生长； 不发酵乳糖的细菌菌落无色透 明； 能发酵乳糖，产酸力弱，菌落 为棕色； 发酵乳酸，产酸能力强，菌落 紫色，有绿色金属闪光 MPN计数法 最大可能数计数又称稀释 培养计数，适用于测定在一个混杂的微生物群落中虽不占 优势，但却具有特殊生理功能的类群。 MPN计数是将待测样品作一系列稀释，一直稀释到将少 量（如lm1）的稀释液接种到新鲜培养基中没有或极少出现 生长繁殖。根据没有生长的最低稀释度与出现生长的最高 稀释度，采用“最大可能数”理论，可以计算出样品单位 体积中细菌数的近似值。 模块三： 抗体和抗血清：抗体致计提的免疫系统在抗原刺激下，由B淋巴细胞或记忆细胞增殖分化成的浆细胞所产生的、可与响应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。抗血清是一种含有多克隆抗体的血清 凝集反应：颗粒性抗原，入细胞、红细胞或表面带有抗原的乳胶颗粒与响应抗体结合，在一定条件下可形成凝集团块的现象 实验材料与仪器 1.1培养基：牛肉膏蛋白胨固体培养基（1.5%琼脂） 1.2水样采集器（灭菌处理），，eppendorf离心管，tips，微量加样枪 1.3无菌水，250ml三角瓶（灭菌），灭菌培养基 2.1乳糖蛋白胨培养液(g/L)：蛋白胨 10，牛肉膏 3，乳糖 5， 氯化钠 5，溴甲酚紫 0.016，pH 7.3 溴甲酚紫为pH指示剂，酸性呈黄色，碱性呈紫色。 2.2 伊红美蓝培养基(g/L)：蛋白胨 10，乳糖 10，磷酸氢二钾 2，2%伊红水溶液 20ml，0.5 %美蓝水溶液 13ml ，琼脂 20， pH 7.2 实验操作步骤 模块一： （一）水样采集 自来水的采集：用酒精灯火焰对自来水龙头灼烧3分钟灭菌，开放水龙头，流水5分钟后，将水龙头关小，在水龙头旁拨去灭菌三角瓶塞，迅速将瓶口对准水龙头，接取水样若干，塞