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实验二不跑电泳详解演示文稿 当前第1页\共有29页\编于星期日\0点 （优选）实验二不跑电泳 当前第2页\共有29页\编于星期日\0点 全触摸屏PCR仪（Bio-Rad） 当前第3页\共有29页\编于星期日\0点 什么是聚合酶链式反应（PCR）？ 聚合酶链式反应 (Polymerase Chain Reaction，PCR）是模拟DNA的复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的方法，从而获得大量的同一序列DNA。每经过一轮扩增，模板分子数增加一倍，经过n次循环后，模板分子数变为原来的2n倍。 当前第4页\共有29页\编于星期日\0点 Khorana (1971)等最早提出核酸体外扩增的设想：“经DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可合成tRNA基因。” 1985年，Kary Mullis在Cetus公司工作期间，发明了PCR。Mullis要合成DNA引物来进行测序工作，却常为没有足够多的模板DNA而烦恼。 1983年4月的一个星期五晚上，他开车去乡下别墅的路上,猛然闪现出“多聚酶链式反应”的想法。 1983年12月，Mullis用同位素标记法看到了10个循环后的49 bp长度的第一个PCR片段； 1985年10月25日申请了PCR的专利，1987年7月28日批准（专利号4,683,202 ），Mullis是第一发明人； 1985年12月20日在Science杂志上发表了第一篇PCR的学术论文，Mullis是共同作者； 1986年5月，Mullis在冷泉港实验室做专题报告，全世界从此开始学习PCR的方法。 当前第5页\共有29页\编于星期日\0点 当前第6页\共有29页\编于星期日\0点 20 21 22 23 N: Molecular number N0: Original number n: Cycles E: efficiency N= N0X2n PCR的指数扩增 N= N0X（1+e)n 当前第7页\共有29页\编于星期日\0点 当前第8页\共有29页\编于星期日\0点 PCR扩增过程 DNA模板变性 退火: 引物 + 模板 新链延伸 50~60℃ 72℃ 30-40次循环 引物 耐热的DNA聚合酶 退火温度：45-60 ℃ 延伸时间：1-2kb/min 循环数：30-40 当前第9页\共有29页\编于星期日\0点 PCR试剂的作用及使用浓度范围 1、DNA模板(template)： λ 噬菌体的质粒DNA(几纳克~几微克) 2、dNTP: 4种dNTP混和物。20-200umolL。大于50mmol/L可抑制Taq酶的活性。 3、10× PCR缓冲液(buffer): 组分如下: 15mmol/L MgCl2（影响引物退火和解链的温度，影响产物的特异性，影响引物二聚体的形成。浓度范围：。浓度太低无PCR扩增，太高则会出现非特异性扩增） 500mmol/LKCl(有利于引物与模板退火，浓度太高则抑制酶活性)、 100mmol/L Tris.HCl (pH8.3)（缓冲PH） 0.1%明胶（稳定酶的活性） 4、引物(primer): 上游引物（M13 F），下游引物（M13 R）（引物终浓度：） 6、Taq DNA聚合酶 当前第10页\共有29页\编于星期日\0点 《分子克隆3》提供的PCR 标准反应条件： 模板1pg-1μg 引物1μmol/L DNA 聚合酶1－5 单位 Mg2＋ 1.5mmol/L dNTPs 200μmol/L KCl 50 mmol/L 当前第11页\共有29页\编于星期日\0点 影响PCR反应的关键因素 1. 引物的质量与特异性； 2. PCR循环条件（退火温度）； 3. Mg2+浓度； 4. 模板DNA的质量； 5. 酶的质量。 当前第12页\共有29页\编于星期日\0点 DNA模板 模板浓度：0.01-1 ng （plasmid , phage）； 0.1-1 ug （genomic DNA）；10倍稀释（cDNA）; 模板中是否含有蛋白质杂质 模板中是否含有Taq酶抑制剂（苯酚） 当前第13页\共有29页\编于星期日\0点 Enzyme concentration ?Taq DNA polymerase is between 1 and 2.5 units. 催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少 dNTP A working stock containing 1 mM each dNTP is recommended dNTP的质量与浓