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光激化学发光免疫分析法快速检测人促卵巢激素 人体促卵激素（hfsh）从垂体前叶排出，是一种单链酪氨酸酶。hFSH 的增高多见于原发性睾丸衰竭、睾丸精原细胞瘤、先天性睾丸发育不全、先天性卵巢发育不全、原发性闭经、原发性性腺功能低下、更年期综合征; 其降低常见于女性不孕症、 长期服用避孕药、大量应用性激素等。目前血清hFSH的检测,临床上已有时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)、酶标法、磁微粒分离酶联免疫法、放射免疫法、化学发光免疫分析法(CLIA)等。光激化学发光免疫分析法(AlphaLISA)起源于1994年发明的发光氧通道免疫分析(LOCI)技术,其具有高通量、易自动化、省样本、快速简便、敏感性高、标记物稳定、标准曲线范围宽、不受样本自然荧光干扰及无放射性污染等优点。目前广泛应用于临床的是传统的非均相免疫分析,如酶联免疫吸附试验(ELISA)、TRFIA,需要通过洗涤来分离结合标记与游离标记,存在操作过程步骤多、不易标准化及自动化等缺点。本研究采用AlphaLISA研制hFSH定量检测试剂,评价各项性能指标,并与其他检测试剂盒进行比较,评价其在临床检测应用中的可行性。 材料和方法 一、 药品、试剂和仪器 2株抗 hFSH 单克隆抗体购自芬兰Medix 公司, hFSH 抗原购自Biodesign公司;hFSH 国家标准品和质控血清为中国药品生物制品检定所产品;生物素购自于Sigma公司;受体微球、链霉亲和素化的供体微球(Lot:599675-A)为美国PerkinElmer公司产品;96孔微孔板为Packard公司产品;检测仪为美国PerkinElmer公司的2300 EnSpireTM检测仪;阴、阳性血清样本各50份来自广州市南方医院;对照试剂盒采用西门子 Immulite2000 促卵泡生成激素CLIA检测试剂盒。 二、 方法 1. 血清hfsh抑制剂溶液配制 采用标准品缓冲液[50 mmol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)-HCl,7.5%牛血清白蛋白(BSA)、0.9%NaCl、0.05% NaN3、0.01% Tween-20,pH值7.8]将hFSH抗原配制成0、1、4、16、64、192 U/L系列参考标准溶液, 每瓶1 mL分装冻干, 4 ℃保存备用。 2. 受体微球中pahs的表达 将0.2 mg hFSH包被抗体加入到带有滤膜的离心管中, 以5 500×g离心5~6 min,用标记缓冲液[0.13 mol/L, pH 值8.0磷酸盐缓冲液(PBS)]重复洗涤6次后,在抗体溶液中加入1 mg受体微球、10 μL 25 mg/mL NaBH3CN(用标记缓冲液配制)、1.25 μL 10%Tween-20,用标记缓冲液将体积补充到200 μL,37 ℃避光振荡反应48 h。加入10 μL 65 mg/mL羧甲氧基胺半盐酸盐(CMO,用0.8 mol/L NaOH配制)封闭未结合位点,37 ℃避光温育1 h后离心洗涤,得到已连接抗体的受体微球,调整受体微球浓度为5 mg/mL。 3. 抗体最适制备 将1 mg 标记抗体加入到带有滤膜的离心管中, 以5 500×g离心5~6 min。用标记缓冲液(0.1 mol/L,Na2CO3/NaHCO3, pH值9.5)重复洗涤6次后,在50 μL抗体溶液中加入5 μL 22 mg/mL生物素[用二甲基亚砜(DMSO)配制],室温避光振动孵育4 h。利用PBS(pH值7.4)4 ℃透析24 h,6 h换液1次,收集透析袋中的液体,并将其抗体浓度调整为 0.5 mg/mL。 4. 链霉亲和素化抗体检测 将25 μL标准品或待检测样本加入微孔板中,并加入以分析缓冲液1∶100比例稀释已连接抗体的受体微球25 μL及1∶400比例稀释的生物素化抗体25 μL,37 ℃振动温育15 min,然后由仪器自动加入链霉亲和素化的供体微球175 μL,37 ℃振动温育15 min后在2300 EnSpireTM检测仪上检测信号值。 结果 一、 敏感 1. 分析敏感性 以零参考标准品测定值的均值加上2倍标准差所得的荧光值扣除本底的荧光值,代入标准曲线方程计算所得最小测定值的浓度为0.09 U/L。 2. hfsh-alas 将低值样本倍比稀释后重复10次测定,计算反应量的变异系数(CV),CV20%时对应的剂量点为0.12 U/L,即自制hFSH AlphaLISA检测试剂功能敏感性为 0.12 U/L。 二、 特异性 1. 数据交叉率 含250 U/L人黄体生成素(hLH)、300 mU/L人促甲状腺素(hTSH)和2 000 U/L绒毛膜促性腺激素(hCG) 样本在本试剂的测定值分别为0.41 U/L、0.24 mU/L 和0.35 U/L, 即交叉率分别为0.16%、0.08% 和0