第五章酶工程制药演示文稿.pptVIP

③最适温度：酶经过固定化后可能导致其空间结构更为稳定，大多数酶经固定化后，最适温度升高。 ④米氏常数（Km)： Km值是表示酶和底物亲和力大小的客观指标。天然酶经固定化后，其Km值均发生变化，底物不同增加的幅度不同。 ⑤最大反应速度（Vm)：大多数的天然酶经固定化后，其Vm与天然酶相同或接近，但固定化的方法不同也有差异，如多孔玻璃共价结合的转化酶，其Vm与天然酶相同，但用聚丙烯酰胺包埋的转化酶， Vm比天然酶小10％。 当前第62页\共有95页\编于星期六\16点 五、固定化细胞的形状与性质 ⒈ 固定化细胞的形状 由于细胞的固定化技术是酶的固定化技术的延伸，许多方法都相同，因此许多固定化细胞的形状与固定化酶的形状相同，如珠状、块状、片状或纤维状等 当前第63页\共有95页\编于星期六\16点 ⒉ 固定化细胞的性质 细胞被固定化后，其中酶的性质、稳定性、最适pH、最适温度和Km值的变化基本上与固定化酶相仿。细胞的固定化主要是利用胞内酶，因此固定化的细胞主要用于催化小分子底物的反应，而不适于大分子底物。 当前第64页\共有95页\编于星期六\16点 六、评价固定化酶（细胞）的指标 1、固定化酶活力的测定方法 酶活力: 在单位时间内单位体积中的底物减少量 或产物增加量来表示。 ⒈ 分批测定法 ⒉ 连续测定法 影响酶活力测定的因素较多，如测定环境、pH、温度、离子强度、酶浓度、激活剂、振荡和搅拌速度以及固定化酶的颗粒大小的变化等均影响酶活力的测定。 当前第65页\共有95页\编于星期六\16点 2、偶联率及相对活力的测定方法 影响酶固有性质诸因素的综合效应及固定化期间引起的酶失活可用偶联率或相对活力来表示。固定化酶的活力回收率是指固定化后固定化酶（细胞）所显示的活力占被固定的等当量游离酶（细胞）总活力的百分数。 偶联率 =（加入酶活力-上清液酶活力）/加入蛋白活力×100% 活力回收率 = 固定化酶总活力/加入酶的总活力×100% 相对活力 = 固定化酶总活力/（加入酶的总活力-上清液中未偶联酶活力）×100% 偶联率=1时，表示反应控制好，固定化或扩散限制引起的酶失活不明显；偶联率＜1时，扩散限制对酶活力有影响；偶联率＞1时，有细胞分裂或从载体排除抑制剂等原因。 当前第66页\共有95页\编于星期六\16点 第四节 固定化酶和固定化 细胞的反应器 一、反应器的类型和特点 ⒈ 间歇式搅拌罐反应器 用于游离酶反应后随即放料。 ⒉ 连续流动搅拌罐反应器 连续进料、连续出料 当前第67页\共有95页\编于星期六\16点 交联法又可分为4种：交联酶法、酶与辅助蛋白交联法、吸附交联法、载体交联法。 交联酶法：向酶溶液中加入多功能试剂，在一定的条件下形成固定化酶的技术。反应速度与酶浓度、试剂浓度、pH、离子强度、温度及反应时间有关。如0.2%木瓜蛋白酶和0.3%戊二醛在pH5.2~7.2，0℃，24h完成反应。 酶与辅助蛋白交联法：在酶溶液中加入辅助蛋白的交联过程。辅助蛋白有：明胶、胶原、及动物血清白蛋白等。 当前第30页\共有95页\编于星期六\16点 吸附交联法：是吸附与交联相结合的技术，其过程是先将酶吸附到载体上再与交联剂反应的方法。 所得的固定化酶称为壳状固定化酶。此法兼备吸附与交联双重优点，即提高固定化酶机械强度又提高酶与载体结合能力，酶分布于载体表面与底物接触良好。 载体交联法：同一多功能试剂分子部分化学集团与载体偶联而另一部分化学基团与酶分子偶联的方法。 当前第31页\共有95页\编于星期六\16点 交联法的特点 反应条件激烈，酶活回收较低。由于酶的功能团，如氨基、酚基、羧基、巯基等参与了反应，会引起酶活性中心结构的改变，导致酶活性下降。 改进办法：在被交联的酶溶液中添加一定量的辅助蛋白如牛血清白蛋白，以提高固定化酶的稳定性。 当前第32页\共有95页\编于星期六\16点 最常用的交联剂是戊二醛，它的二个醛基与酶分子的游离氨基反应形成schiff碱，彼此交联，其方式如下： 当前第33页\共有95页\编于星期六\16点 ⑶包埋法 ①网格型包埋法：将酶或细胞包埋在高分子凝胶细微网格中的称为网格型； ②微囊化包埋法：将酶或细胞包埋在高分子半透膜中的称为微囊型。 ③纤维包埋法：将可形成纤维的高聚物溶于与水不混溶的有机溶剂中，再与酶溶液混合与乳化，然后将乳化液经喷头挤入促凝剂（甲苯、石油醚）中形成纤维，可将酶纤维装成酶柱或织成酶布使用。 当前第34页\共有95页\编于星期六\16点 包埋法的优缺点 优点：一般不需要酶蛋白的氨基酸残基参与反应，很少改变酶的高级结构，酶活回收率较高。 缺点：化学聚合反应包埋酶容易失活，因此必须合理设计反应条件。 适用范围：小分子底物和