荧光定量PCR技术介绍.pptx

实时荧光定量PCR技术介绍1 什么是实时荧光定量PCR？2 什么是实时荧光定量PCR?一种实时监控核酸扩增的技术在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化对PCR过程进行实时监控，以此实现对初始模板的定量分析。PCR反应液加入了各种类型的荧光标记物 荧光定量PCR仪如何工作?所有的定量PCR仪器都有三个共同的组成部分。每个循环结束后，定量PCR仪器通过光学系统记录荧光信号的增加。最后，定量PCR软件计算出数据，用于实验结果的分析。4 荧光定量PCR技术的主要应用5定性分析研究：杂合或纯合子鉴定，单核苷酸多态性（SNPs）分析等绝对定量研究：病毒和病原菌定量分析，基因拷贝数定量，GMO定量检测等相对定量研究： mRNA表达量分析， siRNA效果确认，差异显示结果验证等 荧光定量PCR的数学原理6 PCR动力学曲线和四个阶段7 荧光定量PCR扩增曲线的各种概念基线决定了阈值线，阈值线决定了Ct值。8 什么是基线？基线基线PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，称为基线，图上表现为是扩增曲线的水平部分。对数图谱线性图谱9 参比荧光 (ROX)：校准物理误差10参比荧光是为了均一各个反应体系间的微小差别而设定的。一般来说，在总的reaction mixture中加入Rox荧光染料，在分装时候每一管中体系的微小差别能够通过ROX信号来反映出来，并在后期计算中除去误差。Master Mix中ROX浓度固定，ROX不参与PCR扩增，信号强度只与Master Mix用量有关。ROX的功能：校准物理误差– 耗材质量、管盖厚度、透光性能– 反应体系监控：蒸发、操作 基线扣除?Rn=Rn-背景值11背景荧光是PCR仪的环境荧光强度的大小，也就是PCR仪系统内部存在的固有荧光信号，是一种组合信号，包括从以下几个方面发出的荧光：背景电信号、样本块中的污染物、塑料耗材中的水以及塑料耗材自身。机器使用前会有专门反应板进行背景荧光矫正，后续实验中机器会自动处理这些数据。 什么是阈值？对数图谱线性图谱阈值是PCR 3-15个循环荧光信号标准差的10倍。阈值设定在PCR扩增的指数期。12 什么是Ct值？对数图谱线性图谱Ct值是阈值线与扩增曲线的交点对应在X轴上的值，含义为每个管内荧光信号达到设定的阈值时对应的循环数。Ct值越小，起始拷贝数越大。13 如何使用Ct值计算结果?14 荧光定量PCR的化学原理15 两种化学方法16 TaqMan探针法TaqMan水解探针：5′ 端 荧光报告基团 与靶基因特异性结合的序列 3′ 端 淬灭基团完整的探针：检测不到报告荧光。切断的探针：检测到报告荧光17 4TaqMan探针法561变性2退火3延伸18 SYBR? Green I 染料 SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。19 SYBR? Green I作用机理3延伸1变性2退火45620 SYBR? Green I 方法的局限性21 通过熔解曲线检查产物特异性Tm值： DNA的双螺旋结构打开一半时的温度。原始图谱22 通过熔解曲线检查产物特异性单一PCR产物非特异扩增引物二聚体将溶解曲线一次微分得到峰性图。每一条线代表着某个孔里的反应体系里产物的单一情况，某一条线如果为单峰且在一定合理的温度范围内(一般为80~90℃)则认为正常。对数图谱23 阴性对照的作用24 荧光定量PCR的解析方法25 荧光定量PCR的解析方法荧光定量PCR绝对定量相对定量 2 -△△Ct法双标准曲线法26 绝对定量的定义起始浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，即得到该扩增反应存在的线性关系。根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量。27 绝对定量 绝对定量– 要素：目的基因；标准样本– 优点：给出的是目标基因的绝对数量，数据容易处理– 缺点：必须有标准品；标准品必须准确测定，难以制备和质控28 相对定量的必要性比较两个或两个以上样本中某个基因表达量的变化。关注点： 基因的相对表达量，而不是基因的绝对量！29 相对定量 相对定量– 要素：目的基因；参照样本；未知样本；管家基因– 优点：可以不做标准品；标准品容易制备；使用广泛– 缺点：数据理解困难30 相对定量分析-管家基因筛选管家基因– 维持细胞基本代谢活动所必须的基因，– 如： GAPDH、 Actin、 18S rRNA等筛选方法– 根据文献提供– 通过具体实验筛选31 相对定量分析-两种常用的分析方法相对定量 2 -△△Ct法双标准曲线法3