DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定.docxVIP

/山东大学实验报告2013年m月22日至11月19日 涔姓名—系年级2011级生技一班学号201100140112组别_四题目DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定同组者一、【实验目的】学习和掌握限制性内切酶的分类、特性与作用原理。 掌握对DNA进行限制性内切酶酶切的实验技术。 学习和掌握DNA连接酶的作用原理以及利用TDNA连接酶构建重组DNA分子的实验技术。 4 学习和掌握利用CaCl2制备E.coli感受态细胞的原理与方法。 学习和掌握热激法转化E.coli感受态细胞的原理与方法。 掌握a-互补筛选法的原理。 学习用试剂盒提取质粒DNA的方法。 复习琼脂糖凝胶电泳的原理及方法。 学习和掌握利用琼脂糖凝胶电泳筛选重组质粒。 二、【实验原理】 通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，导致核酸分子多核苷酸链发生水解断裂的蛋白酶叫做核酸酶，其中特异水解断裂RNA分子的酶被称为核糖核酸酶，而特异性水解断裂DNA分子的酶被称为脱氧核糖核酸酶。核酸酶按其水解断裂核酸分子的不同方式，分为两种类型，一种是从核酸分子的末端开始，一个一个核苷酸地消化降解多核苷酸链，叫做核酸外切酶。另一种是从核酸分子内部切割磷酸二酯键使之断裂形成小片段，叫做核酸内切酶。 重组质粒的构建需要对DNA分子进行切割，并连接到合适的载体上进行体外重组。限制性核酸内切酶和DNA连接酶的发现与应用，为重组质粒的构建提供了有力的工具。 限制性核酸内切酶 （1）限制性核酸内切酶是一类能够识别双链^入分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的酶，主要是从原核生物中分离纯化出来的。 根据限制酶的结构，辅因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型，分别是第一型（TypeI）、第二型（TypeII）及第三型（TypeIII）°I型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解，I型酶切割位点是随机的，至少距识别位点1000bp；而II型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的水解，11型限制酶的切割位点一般在识别序列上或与之靠近，而且具有序列特异性，故在基因克隆中有特别广泛的用途。。III型限制性内切酶同时具有修饰及认知切割的作用。III型限制酶的切割位点距识别序列3端为24—26bp。 限制-修复系统：在限制性核酸内切限制酶的作用下，侵入细菌的“外源”DNA分子便会被切割成不同大小的片段，而细菌自己固有的DNA由于修饰酶(通常是一种甲基化酶)的保护作用，则可免受限制酶的降解。限制作用的本质是限制性核酸内切酶的切割反应，修饰作用的本质是甲基化酶的甲基化作用，这两种酶分别为宿主hsdR和hsdM基因的产物，它们作用时的位点识别需要hsdS基因产物的协助。 II型核酸内切限制酶具有3个基本的特性：①在DNA分子双链的特异性识别序列部位切割DNA分子，产生链的断裂；②2个单链断裂部位在DNA分子上的分布通常不是彼此直接相对的；断裂结果形成的DNA片段往往具有互补的单链延伸末端。 限制性核酸内切酶的命名：限制性核酸内切酶的命名普遍采用H-Smith和D-Nathaus于1973年提出的命名系统，根据分理出该酶的微生物的学名进行的，通常为3个字母：第一个字母大写，用斜体，来自微生物属名的第一个字母；第二、第三个字母小写，用斜体，来自微生物种名的头两个字母，如果该微生物有不同的变种和品系，则再加一个来自变种或品系的第一个字母，大写还是小写应根据具体情况而定，但要用正体；从同一种微生物中发现的几种限制酶，则根据其被发现和分离的顺序用I、II、III等罗马数字表示，用正体。例如从E.coli(Escherichiacoli)R株中发现并分离的第一种限制酶被称为EcoRI。 限制性核酸内切酶的基本特点位点特异性：绝大多数的II型限制性核酸内切酶都能够识别由4-8个核苷酸组成的特定的核苷酸序列，这些特定的序列大多呈回文结构，我们称这样的序列为限制性核酸内切酶的识别序列。不过有的限制性核酸内切酶可识别两种以上的核苷酸序列。 同裂酶和同尾酶：有一些来源不同的限制酶能识别同样的核苷酸靶序列，这类酶特称为同裂酶，同裂酶产生同样的切割，形成同样的末端。与同裂酶对应的一类限制性核酸内切酶，它们来源不同，识别的靶序列也各不相同，但都产生相同的黏性末端，称为同尾酶。由一对同尾酶分别产生的黏性末端共价结合形成的位点，称之为杂种位点，但是这类杂种位点的结构，一般是不能够再被原来的任何一种同尾酶所识别的。 限制性核酸内切酶对DNA底物的酶切作用是否完全，直接关系到连接反应、重组体分子的筛选和鉴定等实验结果。核酸内切限制酶活性的充分发挥受到以下几个因素的影响： DNA纯度：在DNA样品中若含有蛋白质，或没有去除干净制备过程中所用的乙醇、EDTA、SDS、酚、氯仿和某些高浓度金属离