D2定性定量检测.docxVIP

D2受体定性定量检测试验 膜的制备PBS冲洗过的细胞悬液，3000g,4＞离心5分钟。 小心的弃去上层液，用30ml冰凉的缓冲液重新悬浮细胞。（缓冲液I：20mMHEPES缓冲液+10mMEDTA,PH=7.4）。细胞混匀20-30秒，然后39000g,4°C离心45min。 离心后弃去上层清液，用30ml冰冷的缓冲液再悬浮。（缓冲液II：20mMHEPES缓冲液+0.1mMEDTA,PH=7.4）。 细胞混匀20-30s，然后39000g，4°。离心45min。 小心的弃去上层液，用5ml冰凉的缓冲液3重新悬浮细胞。（缓冲液III：20mMHEPES缓冲液+0.1mMEDTA+10%甘油,PH=7.4）。 膜蛋白浓度使用Bradford法蛋白定量测定（考马斯-）膜蛋白使用缓冲液III（20mMHEPES缓冲液+0.1mMEDTA+10%甘油,PH=7.4）稀释到1mg/ml，均分到2ml管中，1ml/管。 -80C储存。 Bradford法蛋白定量测定一、实验原理双缩脲法（biuret法）和folin—酚试剂法（lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。 1976年由bradford建立的考马斯亮兰法（bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。 考马斯亮兰g-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。 在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。 二、试剂与器材1.试剂： ①标准蛋白质溶液，用g—球蛋白或牛血清清蛋白（bsa），配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。 ②考马斯亮兰g—250染料试剂：称100mg考马斯亮兰g—250，溶于50ml95%的乙醇后，再加入120ml85%的磷酸，用水稀释至1升。 2.器材： 可见光分光光度计旋涡混合器试管16支三、操作方法1.标准方法取16支试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分为两组按表中顺序，分别加入样品、水和试剂，即用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用无离子水补充到0.1ml。最后各试管中分别加入5.0ml考马斯亮兰g—250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。未知样品的加样量见下表中的第8、9、10管。 加完试剂2-5分钟后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值A595，空白对照为第1号试管，即0.1mlH2O加5.0mlg—250试剂。 注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。 考马斯亮兰法实验表 管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 标准蛋白质（1.0mg/ml） 0 0.01 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 未知蛋白质（约1.0mg/ml） 0.02 0.04 0.06 蒸馏水 0.1 0.09 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0.08 0.06 0.04 考马斯亮蓝g-250试剂 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 每管中的蛋白质量（mg） 光吸收值（A595） （3）用标准蛋白质量（mg）为横座标，用吸光度值A595为纵座标，作图，即得到一条标准曲线。由此标准曲线，根据测出的未知样品的A595值，即可查出未知样品的蛋白质含量。 0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.50。 2.微量法 当样品中蛋白质浓度较稀时（10—100mg/ml），可将取样量（包括补加的水）加大到0.5ml或1.0ml,,空白对照则分别为0.5ml或1.0mlH2O,考马斯亮蓝g—250试剂仍加5.0ml,同时作相应的标准曲线，测定595nm的光吸收值。 0.05mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.29。 放射性配体结合试验 材料和试剂 人多巴胺D2受体膜、3H螺哌隆、氟哌啶醇、96孔平板 Bindingbuffer:50mMHEPES,10mMMgSO4,5mMCaCl2pH7.4,at4°C Washbuffer:50mMHEPES,pH7.4,at4°C 冷配基 储存液：2mM冷配基溶于乙醇中，储存于-20°C 5Xsolutio