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假丝酵母菌的药敏性及临床用药 随着各种抗癫痫药物、免疫抑制剂、类固醇和抗生素的临床应用，真菌感染的发病率呈上升趋势。虽然各种抗真菌药物的出现给念珠菌病的治疗带来了新的选择,但有关抗真菌药物的耐药报道也逐年增多。有研究发现,由于氟康唑的广泛应用而导致菌种由白色假丝酵母菌向非白色假丝酵母菌转变。目前关于口腔念珠菌病药敏试验的研究报道相对缺乏,因此,本研究采用CHROMagar假丝酵母菌显色培养基和体外抗真菌药敏试验(NCCLSM27-A方案)探讨口腔假丝酵母菌感染患者口腔菌种的分布情况及对几种临床常用抗真菌药物的敏感性,为临床用药提供参考。 1 材料和方法 1.1 临床诊断和排除标准 选择2003年9月—2004年2月就诊于四川大学华西口腔医院黏膜病科的口腔念珠菌病患者61例为试验组,其中男性13例,女性48例,年龄22~81岁,平均62.59岁。纳入标准:临床诊断为口腔念珠菌病,真菌培养达到口腔念珠菌感染参照诊断标准(含漱液菌落数超过300 CFU/m L)。排除标准:不能自主含漱的婴幼儿患者。另外选择健康自愿者43例作为对照组,其中男性15例,女性28例,年龄24~79岁,平均63.77岁。对照组经详细询问和口腔黏膜检查,有以下情况者予以排除:患有口腔黏膜病、配戴全口或半口义齿者;患有严重牙周病或龋病的患者;长期或近期(2周内)使用广谱抗生素者;近期内(2周内)使用抗真菌药物者;长期使用肾上腺皮质激素或其他免疫抑制剂者;患有糖尿病、甲状腺功能低下、免疫缺陷等系统性疾病者。 1.2 原粉、培养基和培养基 法国CHROMagar假丝酵母菌显色培养基(成都培洋生物工程有限公司)、沙保罗葡萄糖琼脂(杭州天和微生物制剂有限公司)、氟康唑(fluconazole,FCZ)原粉(杭州民生药业集团有限公司)、酮康唑(ketoconazole,KCZ)原粉(武汉新思维药业集团)、制霉菌素(nystatin,NYS)原粉1(Sigma公司,美国)、NYS原粉2(浙江省震元制药有限公司)、RPMI-1640培养基(Hycolone公司,美国)、三氮吗啡啉丙磺酸(3-N morpholinopropanesulfonic acid,MOPS)缓冲液(Sigma公司,美国)、96孔平底细胞培养板(Corning公司,美国)。 1.3 菌落培养和最适菌种的制备 采用含漱法收集口腔假丝酵母菌标本。每位患者采用0.1 mmol/L、p H7.2的无菌PBS液10 m L充分含漱1 min后吐于无菌小烧杯内,2 000 r/min离心10 min,弃上清液,留1 m L混匀沉淀,在超净工作台内,用无菌棉签均匀涂布于CHROMagar假丝酵母菌显色培养基,37℃孵育48 h。白色假丝酵母菌菌落颜色为绿色或翠绿色,直径约2 mm;热带假丝酵母菌菌落颜色为蓝灰色或铁蓝色,直径约1.5 mm;克鲁斯假丝酵母菌菌落颜色为粉红色,边缘模糊,有微毛,直径约4~5 mm;光滑假丝酵母菌菌落颜色为紫色,直径约2 mm;其他假丝酵母菌菌落为白色。用消毒的接种环挑取分离的单个菌落放入灭菌蒸馏水,混匀,置-20℃冰箱保存备用。 1.4 白色假丝菌口中分离的外剂敏试验 1.4.1 添加ep管 采用M27-A方案-微量稀释法进行假丝酵母菌的体外药敏试验。FCZ原粉用灭菌双蒸水溶解,贮存浓度为6 400μg/m L;KCZ、NYS1和NYS2原粉均用无菌二甲基亚砜液溶解,RPMI-1640稀释,贮存浓度分别为1 600μg/m L、1 850μg/m L和1 850μg/m L。将母液分装于无菌EP管,置-20℃冰箱保存备用。实验时取母液室温下融化,用RPMI-1640-MOPS稀释100倍,使FCZ、KCZ、NYS1和NYS2的浓度分别为64μg/m L、16μg/m L、18.5μg/m L和18.5μg/m L,再用RPMI-1640-MOPS以2倍浓度进行倍比稀释,FCZ稀释成10个浓度梯度,从64μg/m L到0.125μg/m L,分别为64μg/m L、32μg/m L、16μg/m L、8μg/m L、4μg/m L、2μg/m L、1μg/m L、0.5μg/m L、0.25μg/m L、0.125μg/m L;KCZ稀释成10个浓度梯度,从16μg/m L至0.03μg/m L;NYS1和NYS2均稀释成9个浓度梯度,从18.5μg/m L至0.07μg/m L。 1.4.2 菌落形态鉴定 将保存的白色假丝酵母菌菌种在新鲜配制的沙保罗葡萄糖琼脂培养基上转种2次,均于37℃孵育24 h。挑取单个菌落做革兰染色,显微镜下观察菌落形态,如确定为假丝酵母菌,无其他杂菌污染,方可进行下一步实验。挑取生长良好的直径大于1 mm的菌落,溶于3 m L 0.85%生理盐水中制成混悬液