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兔骨髓来源内皮祖细胞的分离培养 内陆节（epcs）是骨髓的一部分，存在于1590年的中循环中，在生长因子的影响下，它可以分为内皮细胞（ecs）的前细胞，也被称为血管母细胞。它和造血细胞来源于同一前体细胞,这一前体细胞被称为造血干/祖细胞。EPCs多持续存在于骨髓、外周血、脐带血和胎儿肝脏中,其中又以骨髓和脐带血中含量最高且增殖能力最强,因此常常作为获得EPCs的重要来源。本实验通过密度梯度离心联合差速贴壁法获取EPCs,并进行培养及鉴定。 1 材料和方法 1.1 临床抗氧合酶基因检测 1 w龄幼兔(辽宁医学院动物实验中心提供)、10%胎牛血清(Hyclone)、DMEM培养液(Sigma)、M199培养液(Hyclone)、EGF(英国PeproTech)、血管内皮生长因子VEGF(英国PeproTech)、碱性成纤维细胞生长因子 bFGF(英国PeproTech)、淋巴细胞分离液(天津灏洋生物公司)、胰蛋白酶(Hyclone)、FITC 标记的荆豆凝集素(美国Sigma)、DiI标记的乙酰低密度脂蛋白(美国Vector)、人纤维连接蛋白(美国Chemicon)、羊抗兔CD34抗体、羊抗兔CD133抗体、羊抗兔VEGFR-2/KDR抗体、FITC标记的羊抗IgG(美国SantaCruz)等。 1.2 方法 1.2.1 小鼠骨髓中mns的分离纯化 取1 w的兔四肢长骨,直接用PBS冲出骨髓,将冲出的骨髓液收集在带刻度的离心管中,800 rpm×5 min,可见分3层,上层为脂肪等杂质,中层为PBS,下层沉淀为骨髓及血细胞。留取下层沉淀,加入4 mL培养基,用吹打管混匀,在带刻度离心管中加入4 mL淋巴细胞分离液,用滴管取混匀后的骨髓液,沿管壁缓慢叠加于分层液面上,注意保持清楚的界面。水平离心2 000 rpm×20 min。离心后管内液体分为3层,上层为血浆和PBS液,下层主要为红细胞和粒细胞,中层为淋巴细胞分离液,在上、中层界面处有一以单个核细胞(MNCs)为主的白色絮状狭窄层。用枪头插到絮状层,吸取MNCs。用PBS洗涤2次(1 000 rpm离心5 min),弃上清,DMEM完全培养液(含体积分数为10%的胎牛血清、青霉素100 U/mL、链霉素100 U/mL)重悬细胞,接种于培养瓶里,在37 ℃、5%的CO2饱和湿度培养箱中培养。 1.2.2 培养基和培养 原代骨髓间充质干细胞培养48 h后首次换液,获取未贴壁的细胞,1 000 rpm离心10 min,然后重悬在M199 培养基中(含有10%胎牛血清,10 μg/LVEGF、2 μg/LbFGF、10 μg/LEGF)。接种在预先包被有人纤维连接蛋白(HFN)的培养瓶中,37 ℃,5%CO2的湿度培养箱中培养。3 d后首次换液,去除其中不贴壁细胞,以后每隔3～4天换液1次。当细胞融合达到80%～90%时可传第1代,以后每8～10天可传1代。 1.2.3 流式细胞检测 (1)细胞形态观察 倒置相差显微镜下,每日观察细胞生长情况和形态学变化;(2)流式细胞检测 取消化培养的P3代细胞,离心后去上清液,PBS稀释并计数;将细胞悬液以每管1×105个细胞,分装于各个流式管,预先设定空白对照管、单纯二抗管及CD133、CD34、VEGFR-2各1管;用PBS洗涤后离心2次,完全去血清后,加入300 μL的PBS,加1 μL的CD133、CD34、VEGFR-2的一抗,避光保存30 min;加入1 mL的PBS离心去上清后,加入300 μL的PBS,加入1 μL FITC标记的二抗,避光存放30 min;加入1 mL的PBS离心去上清后,每管加入150 μL的PBS准备进行流式细胞仪检测;(3)DIL-ac-LDL及FITC-UEA-1双荧光标记 原代细胞传代后,培养至第10 d,取消化培养的细胞,离心后去上清,PBS 漂洗2 min,2次;加入5 mL DIL-ac-LDL(10 μg/mL),37 ℃孵育1 h;PBS漂洗2次;2%多聚甲醛固定细胞10 min;PBS 漂洗2次;加入5 mL FITC-UEA-1(10 μg/mL),37 ℃孵育1 h。用激光共聚焦显微镜观察。DIL-ac-LDL和FITC-UEA-1双染色阳性细胞被认为是EPCs。 2 结果 2.1 细胞生长和干酵母株分布 培养48 h后即出现梭形细胞。第4 d换液后可见细胞集落形成,中央为圆形细胞,梭形贴壁细胞从集落中央以放射状向外周生长(见图1)。1 w以后细胞生长旺盛,集落边缘细胞呈纺锤形近似单层生长。培养约7～10 d成片生长的细胞集落相互连接,呈典型的“鹅卵石“样外观铺满培养瓶(见图2)。2 w左右可见由多个细胞首尾相连呈鱼贯样排列或两排细胞平行排列呈条索状或管状结构(见图3)。 2.2 流式细