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不同提取方法提取水稻叶片总蛋白的比较 1975年，ofarrils提出的双向沉淀电泳技术（2-de）是蛋白质组学中广泛使用的蛋白质分离技术。其基本原则是根据蛋白质的等电点（pi）和含量（mw）的大小，将其分离两次不同方向的电离作用，具有较高的分辨率和良好的重复性。蛋白质的提取是双向电泳中非常关键的一步,针对不同的研究目的选择适合的蛋白提取方法可以获得满意的二维电泳图谱。植物组织样品由于富含色素、酚、脂类、多糖等干扰物质,因而较难获得提纯的蛋白质。现有的用于植物组织双向电泳总蛋白提取方法主要包括三氯乙酸(trichlomacetic acid,TCA)/丙酮沉淀法、传统的酚法、十二烷基硫酸钠(SDS)法和镁/乙基苯基聚乙二醇(Mg/NP-40)提取法等。其中,在植物蛋白质组学尤其是在水稻蛋白质组学中最常用的蛋白提取方法是TCA/丙酮沉淀法。 水稻(Oryza sativa)是一种重要的粮食作物,它因为基因组较小、分布广泛等优点而作为单子叶植物遗传和分子生物学研究的模式植物。随着水稻全基因组测序的完成,水稻蛋白质组的研究越来越被人们所重视。 在使用双向电泳技术检测时,常由于高丰度蛋白的干扰而造成低丰度蛋白很难被检测到。在植物叶片中,1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Ribulose-1 , 5-Bisphosphate Carboxylase/ Oxygenase, RuBisCO)是可溶性蛋白中含量最高的蛋白质,大约占50%,由于它丰度极高,在使用双向电泳技术分离植物蛋白质组时常会使一些低丰度蛋白难以被检测到,给蛋白质组学分析造成一定困难。S. Tae Kim等人用改进的Mg/NP-40提取法获得的水稻叶片总蛋白能够有效地减少分离蛋白中RuBisCO蛋白的含量,使双向电泳分析可以识别更多的低丰度蛋白。然而,TCA/丙酮沉淀法和Mg/NP-40提取法所获得的水稻叶片总蛋白在双向图谱中分布的具体情况,至今还无人报道。 本研究采用TCA/丙酮沉淀法和Mg/NP-40提取法分别提取水稻苗期叶片的总蛋白,应用双向电泳技术进行分离分析,确定了这两种水稻叶片总蛋白提取方法在双向图谱中的分布特征。 1 材料和方法 1.1 水稻叶片总蛋白的提取 采用水稻粳稻品种松粳6号(由五常种子公司提供),在实验室光照培养架培养(3000lux,25℃±2,光照16h/d)3周后用于提取水稻叶片总蛋白。 1.2 水稻叶片的提取 (1)TCA/丙酮沉淀法:取1.5 g水稻叶片在液氮中充分研磨至粉末状,并转移至无菌离心管中;加入9 mL -20 ℃预冷的蛋白提取液Ⅰ(含0.07% β-巯基乙醇的10%三氯乙酸丙酮溶液)。充分混合后-20 ℃静置至少1h。4 ℃,15000 r/min离心10 min。弃上清。沉淀重悬浮于9 mL -20 ℃预冷蛋白提取液Ⅱ(含0.07% β-巯基乙醇的丙酮溶液)中,-20 ℃放置1h。4 ℃,15000 r/min离心10 min,弃上清。重复清洗一次。沉淀重悬于9 mL -20 ℃预冷的蛋白提取液III(含0.07% β-巯基乙醇的80%丙酮溶液)中,-20 ℃中静置1h。4 ℃,15000 r/min离心10 min,弃上清。将沉淀真空干燥后,研磨成粉末状,-80 ℃保存备用。(2)Mg/NP-40提取法:取1.5 g水稻叶片在液氮中充分研磨至粉末状,并转移至无菌离心管中;加入10 mL预冷的Mg/NP-40提取缓冲液(0.5 M Tris-HCl,pH值8.3, 2% NP-40、20 mM MgCl2、2% β-巯基乙醇、1 mM PMSF、1% PVP),冰上放置30 min。4 ℃,12000 r/min离心15 min。取上清,加入50 mL -20 ℃预冷的丙酮, -20 ℃静置1 h。4 ℃,3000 r/min离心10 min。弃上清,将沉淀真空干燥后,-80 ℃保存备用。 1.3 蛋白凝胶凝胶电泳 用300 μL水化上样缓冲液(8 M 尿素、4% CHAPS、6 mM DTT、0.2% w/v Bio-Lyte)溶解30 mg蛋白粉。37 ℃水浴30 min。4 ℃,12000 r/min离心30 s,取上清。Bradford法测定蛋白浓度。双向电泳采用Bio-Rad公司电泳系统,参照文献和Bio-Rad操作指南进行。IPG胶条为17 cm(pH值4.0～7.0;Bio-Rad),第二向聚丙烯酰胺凝胶电泳胶浓度为13%。染色采用银染。用普通凝胶成像系统(UVP)采集图像。每种蛋白提取方法的双向电泳进行三次重复。 1.4 图像统计分析 采用Image Master图像分析软件(Amersham)对图像进行分析。编写工作组群,调整图像灰度使所有蛋白点都清晰可见,蛋白点检测时选取相同参数(smooth:4,Mi