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ca丙酮沉淀法在尿液蛋白提取中的应用 尿液蛋白组主要是为了找到新的生物标记分子，以确定疾病的诊断、治疗和预后。为探讨蛋白回收率较高且易于应用的蛋白沉淀方法, 2009年1月~2009年11月, 采用丙酮沉淀法、ACN/0.1%TFA沉淀法、TCA/丙酮沉淀法三种不同方法沉淀尿液蛋白, 并经对双向电泳 (2-DE) 图谱, 研究探讨几种方法对尿液蛋白2-DE结果的影响, 现报告如下。 1 数据和方法 1.1 试剂和仪器 主要仪器与试剂:丙酮、三氯乙酸 (Trichloroa ceticacid, TCA) 、丙烯酰胺 (Acrylamide, AM) 、甘氨酸、三羟甲基氨基甲烷 (Tris) 、四甲基乙二胺、3-[3-胆酰胺丙基]乙二胺-1-丙磺酸、二硫苏糖醇 (Dithiothreitol, DTT) 、二烷基硫酸钠 (SDS) 等试剂均购自中国医药 (集团) 上海化学试剂公司, 碘乙酰胺 (iodacetamide) 和三氟乙酸 (Trifluoroacetic acid, TFA) 则购自瑞士Fluka;Sypro Ruby蛋白胶染色液购自美国Invitrogen公司;固相pH梯度IPG干胶条、IPGphor电泳仪、Protein II垂直电泳单元、高速低温离心机等试剂仪器。尿液标本均来自于本院外科住院患者, 尿液样本均收集第1次晨尿中段尿约30 ml, 经4℃、1 500 g离心15 min去除细胞碎片, 置于-80℃冰箱中存放备检。 1.2 检测方法 1.2.1 低温离心-静置液法 取5 ml尿液样本, 加入5 ml 4℃丙酮溶液, 二者混匀后于-20℃静置24 h, 经4℃低温离心15 min (10000 r/min) 后弃除上清液, 并将沉淀物液氮吹干备用。 1.2.2 acn.0.1%ta沉淀方法 1.2.3 低温离心法破碎沉淀物 取5 ml尿液标本, 加入90%TCA溶液17.5 ml, -20℃沉淀24 h, 后经4℃低温离心15 min (10 000r/min) , 再将沉淀物置于5 ml的丙酮溶液中超声破碎重悬, 再4℃低温离心15 min (10 000 r/min) 后弃除上清液, 并将沉淀物液氮吹干备用。 1.3 评估方法 1.4 统计学处理 所得数据均采用SPSS 13.00软件包进行统计处理, 数据以均值±标准差表示, 组间比较进行t检验, 计数资料进行χ2检验, 以P0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 f0沉淀法 见表1, 其中TCA/丙酮沉淀法所得蛋白点数高于ACN/0.1%TFA沉淀法及丙酮沉淀法, ACN/0.1%TFA沉淀法比丙酮沉淀法所得的蛋白点数均值比较差异有统计学意义 (P0.05) ;TCA/丙酮沉淀法的蛋白回收率高于ACN/0.1%TFA沉淀法及丙酮沉淀法, ACN/0.1%TFA沉淀法高于丙酮沉淀法 (P0.01) 。 2.2 通过2-depcon法获得的2-de图的背景清晰，蛋白质点分辨率高 而其余两种方法得到的蛋白点清晰度欠佳, 在2-DE胶上发现有较多水平条纹存在。 3 高校尿沉淀蛋白的分离效果 在对尿液蛋白质组学进行研究的过程中, 为消除尿液低蛋白浓度、高盐浓度的影响, 屏蔽一些高丰度蛋白的作用, 临床研究时往往通过透析、冻干等方法进行联合沉淀、固态提纯、离心过滤、超速离心这一系列的方式来获取蛋白。但经过一系列复杂的处理步骤, 会导致结果所得的蛋白回收量较低。因此临床需要考虑通过选取回收蛋白率高、且过程最为优化的方法进行尿液浓缩以便实现尿液分析的最终目的。 TCA可以消除干扰IEF的盐类物质及其他分子, 降低尿液的导电能力。通过本文的比较发现, 尿液样本经20%TCA/丙酮沉淀法沉淀后所得的蛋白点数及蛋白回收率分别为 (392±14) %与 (69.4±7.8) %, 较ACN/0.1%TFA沉淀法与丙酮沉淀法的蛋白点数及蛋白回收率均有显著优势。同时本文发现经TCA沉淀24 h所得到的蛋白回收率高于TCA沉淀仅4 h者, 这说明延长沉淀时间对蛋白沉淀有着积极影响。综上所述, 20%TCA/丙酮沉淀法能同时脱盐和浓缩尿液;尿液样本不需经额外分离、脱盐、冷冻干燥和其他前加工过程, 步骤较为简单, 故能获得较高的蛋白回收率以及高分辨率的2-DE图谱。其作为较为理想的蛋白沉淀提取方法, 具有高效、简便的显著优势, 值得在临床研究中广泛推广。 使用该沉淀法沉淀尿液蛋白质, 经4℃低温离心15 min (10 000 r/min) 后弃除上清液, 并将沉淀物液氮吹干备用。 蛋白回收率=沉淀后的收集的尿总蛋白含量/沉淀前的尿总蛋白含量×100%。