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根结线虫侵染不同阶段的染色体鉴别方法 据估计，植物寄生线虫每年造成约1570亿美元的世界农业生产损失。病原根结线虫是植物寄生线虫中一大类群, 一些属种在全世界严重地危害重要的农经作物。自1855年Berkeley在英国的感病黄瓜上首次观察到根结, 并发现根结线虫病原后, 有关病原侵染寄主的动态变化、病原的形态、检测与鉴定等, 一直是植物病理学家关注的重要领域。 病原根结线虫属于固着性内寄生线虫, 在危害农作物的侵染循环中, 以虫卵、雌虫和幼虫形态出现。初期以2龄幼虫 (Second stage juvenile, J2) 侵入寄主植物的根系组织, 在根内常迁移至分化区的皮层组织内定居, 并刺激根组织形成巨型细胞, 以提供其营养成分, 分化的雌虫进行生长和繁殖, 进而产生由卵壳包裹大量卵粒的卵块。虫卵孵化成2龄幼虫后, 即可发生下一个侵染循环。一般而言, 通过解剖镜即可观察到上述侵染循环中出现的病原形态。为了快速寻找和确定病原、侵染过程中病原动态变化的病理学观察、检测以及病原的分类鉴定等, 方忠达和刘维志等根据研究结果及相关的报道, 在他们的专著中分别对病原线虫染色观察的许多方法进行了阐述。根据线虫的动态变化, 近年来报道的关于根结线虫染色方法中的主要染料包括对侵染初期根系组织内J2幼虫染色观察的染料是酸性品红[5~8];侵染根系后期, 对巨型细胞内部的病理学染色观察时使用较多的染料也是酸性品红或番红-固绿对染;对根系表面的卵块染色观察使用的染料是phloxine B(PB) 或cochenille red A(CA) ;对死幼虫与活幼虫鉴别的染料使用的是荧光素二乙酸酯 (FDA);对活幼虫标记所用的染料有异硫氰酸荧光素 (FITC)[14~15]和荧光素二乙酸酯;对雌虫会阴花纹进行染色观察使用的染料是甲烯蓝。对病原根结线虫在不同侵染时期进行染色观察, 有助于对病原进行组织病理学的研究、检测、形态鉴别及抗性评价等。 文章对报道的一些染色方法进行了尝试和比较, 探索了以甲基蓝和吖啶橙染料的染液分别对J2幼虫的死虫与活虫染色鉴别方法及利用CA染料的染液对卵块团和雌虫会阴花纹的染色观察方法。 1 材料和方法 1.1 染料、试剂和仪器 烟草 (Nicotiana tabacum Linn) 品种为红花大金元和云烟97, 由云南省烟草公司红河州公司提供。油萝卜 (Raphanus sativus var.oleiferus) 品种为A24, 油菜 (Brassica napus) 品种为Madora, 番茄 (Lycopersicon esculentum Miller) 品种为Moneymaker, 由德国JKI-Institute for Breeding Research on Horticultural and Fruit Crops的H.Budahn博士提供。 南方根结线虫 (Meloidogyne incognita) 、花生根结线虫 (M.arenaria) 、爪哇根结线虫 (M.javanica) 为种植烟草病圃土中的虫卵和J2幼虫, 病圃土采自云南省弥勒市太平镇发生根结线虫病害的烟田。北方根结线虫 (M.hapla) 为德国JKI-Institute for Breeding Research on Horticultural and Fruit Crops的H.Budahn博士提供的J2幼虫。 染料:酸性品红 (天津市标准科技有限公司) ;溴酚蓝 (天津市瑞金特化学品有限公司) ;番红 (天津市瑞金特化学品有限公司) ;甲基蓝 (天津市标准科技有限公司) ;吖啶橙 (国药集团化学试剂有限公司) ;Phloxine B (Sigma-Aldrich) ;Cochenille Red A (Appli Chem) 。试剂:碘 (天津市风船化学试剂有限公司, AR) ;碘化钾 (天津北科化学品有限责任公司, AR) ;次氯酸钠 (有效氯天津市富宇精细化化工有限公司, AR) ;无水乙醇 (四川西陇化工有限公司, AR) ;异丁醇 (西陇化工股份有限公司, AR) ;甲醛 (天津市致远化学试剂有限公司, AR) ;乳酸 (天津市风船化学试剂有限公司, AR) ;甘油 (天津市科密欧化学试剂开发, AR) ;三乙醇胺 (天津市化学试剂三厂, AR) ;蔗糖 (天津市瑞金特化学品有限公司, CR) 。 根系组织内线虫染液的配制:鲁戈氏碘液:4 g的碘与6 g碘化钾用水溶解定容到100 m L。乳甘合剂:20 m L乳酸+40 m L甘油+25 m L蒸馏水。0.05% (0.1%酸性品红:0.085 g酸性品红加蒸馏水定容到100 m L) 。0.1%次氯酸钠:10 m L次氯酸钠加蒸馏水定容到100 m L。50%和70%的酒