hplc法测定土茯苓药材中落新妇苷和总黄酮的含量.docxVIP

hplc法测定土茯苓药材中落新妇苷和总黄酮的含量 土耳其语是一种含有糊精草素的复合科植物。土茯苓可以除湿解毒、通利关节,用于治疗湿热淋浊、带下、痈肿、疖廯、梅毒及汞中毒所致的肢体拘挛、筋骨疼痛,主产于广东、湖南、安徽、湖北、浙江、四川等地。 据文献报道,土茯苓中含落新妇苷、异落新妇苷、槲皮素、土茯苓苷等黄酮类物质,其中以落新妇苷含量较高。落新妇苷具有的利尿、镇痛作用与土茯苓的除湿、解毒等功效密切相关,可以作为土茯苓药材质量控制的指标成分。由于土茯苓中所含的黄酮类成分众多,因此控制其中总黄酮的含量也具有重要的意义。曾有报道用HPLC法测定土茯苓中的落新妇苷含量,流动相中所加酸为磷酸,磷酸不易挥发,不利于进行质谱等检测手段。本文建立HPLC法测定了土茯苓中落新妇苷的含量,选用乙腈-水-冰醋酸(18∶82∶1)为流动相,在选定的条件下,落新妇苷和其他组分分离良好,所加酸为挥发性酸,可用于液-质联用。土茯苓中总黄酮的含量测定目前尚无文献报道,本文建立比色法,以硝酸铝为显色剂对土茯苓中的总黄酮含量进行了测定。应用所建立的方法测定了7批不同来源土茯苓药材中落新妇苷与总黄酮含量,并考察其相关性,为土茯苓药材的质量控制提供了依据。 1 落新妇苷对照品 LC-10AT vp型高效液相色谱仪(日本岛津公司),KH 5200型超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司),UV-1800 PC型紫外分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)。 落新妇苷对照品(本实验室自制,mp 172~173 ℃,经过UV、IR、1H-NMR、13C-NMR、MSD等测定,其数据与文献一致,鉴定为落新妇苷,HPLC归一化法测定纯度为98.6%,用紫外分光光度法按吸收系数测得含量为98.5%),乙腈(Fisher,美国)、冰醋酸为色谱纯,甲醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠均为分析纯,水为乐百氏纯净水。 土茯苓药材共7批,产地为湖南、广西、浙江,经本院王天志教授鉴定为土茯苓。 2 溶液的制备 2.1 对照品储备液 精密称取落新妇苷对照品适量,加甲醇溶解并定量稀释制成浓度为1 mg·mL-1的落新妇苷对照品储备液;精密量取落新妇苷对照品储备液适量,加甲醇定量稀释制成浓度为0.1 mg·mL-1的对照品溶液R1(供HPLC用)和浓度为0.2 mg·mL-1的对照品溶液R2(供测定总黄酮用)。 2.2 超声处理法 精密称取土茯苓药材粉末(过50目筛)约0.5 g,置25 mL量瓶中,加甲醇约20 mL,放置1 h,超声(500 W,40 kHz)处理30 min,加甲醇稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得。 3 新女性的含量是由降低的 3.1 色谱柱及检测波长 使用Shim-pack VP-ODS(150 mm×4.6 mm,5 μm)色谱柱,流动相为乙腈-水-冰醋酸(18∶82∶1),流速1.0 mL·min-1,检测波长为290 nm,柱温30 ℃,进样量10 μL。在上述色谱条件下,落新妇苷峰与相邻峰可完全分离,按落新妇苷峰计算,理论板数为8.5×103。 3.2 法律研究 3.2.1 线性关系的考察 分别精密量取对照品溶液R2适量,用甲醇稀释成浓度分别为4,12,20,40,120,200 μg·mL-1的系列对照品溶液,取各对照品溶液10 μL进样分析,测定峰面积值,以峰面积值(A)对进样量(X,μg)进行线性回归,得回归方程: A=1.835×106X+1.858×103r=1.000 结果表明,落新妇苷进样量在0.04~2.0 μg范围内,峰面积与进样量呈良好的线性关系。 3.2.2 加样回复突变试验 精密吸取落新妇苷对照品溶液R1和供试品溶液各10 μL,按“3.1”项下色谱条件,于同一日内第0,2,4,6,8 h和第0,1,2,3 d各进样1次,记录峰面积,计算日内精密度和日间精密度。测得对照品溶液R1和供试品溶液日内精密度的RSD分别为0.2%和0.9%,日间精密度的RSD分别为0.8%和1.1%。本法日内精密度和日间精密度良好。 3.2.3 新妇苷含量测定 精密称取土茯苓药材粉末约0.5 g,共6份,分别按“2.2”项下方法制备供试品溶液,按“3.1”项下色谱条件进样测定落新妇苷含量。结果落新妇苷的平均含量为5.634 mg·g-1,RSD为1.5%,本法重复性良好。 3.2.4 加样回收率试验 精密称取已知含量(3.032 mg·g-1)的土茯苓粉末0.25 g,共9份,平均分为3组,每组分别精密加入对照品储备液1,1.5,2 mL,按“2.2”项下方法制备供试溶液,再按“3.1”项下的色谱条件测定落新妇苷的量,并计算回收率。结果落新妇苷低、中、高3个浓度的回收率(n=3)分别为98.6%(RSD=0.7%),99.2%(RSD=0.7%),99.8%(RSD