DNA甲基化调控p16表达在替格瑞洛改善血管内皮功能中的作用及机制.docx

? ? DNA甲基化调控p16表达在替格瑞洛改善血管内皮功能中的作用及机制 ? ? 朱伯谦，宋兵战，陈凯，姜旭，王振兴 南京中医药大学附属医院心内科，江苏 南京 210029 替格瑞洛是一种新型抗血小板聚集药物，无需通过肝脏代谢活化，可直接抑制血小板P2Y12 受体，减少ADP的结合位点［1］。大量研究表明，与氯吡格雷相比，替格瑞洛能显著降低急性冠脉综合征（acute coronary syndrome，ACS）患者的病死率［2］。因此，替格瑞洛目前已成为指南推荐的ACS抗血小板聚集首选药物［3］。 有研究者认为替格瑞洛改善ACS 患者预后不单纯依赖其强效的抗血小板聚集作用［4］。血管内皮功能障碍在冠心病的发生发展中起着重要的作用，有研究发现替格瑞洛可能还具有改善血管内皮功能的作用，但具体机制尚未明确［5-6］。p16 基因是一种调控细胞周期的重要基因，其编码产物p16 蛋白直接调控细胞周期G1～S 转换，负调节细胞增殖及分裂，并促进细胞凋亡和衰老［7］。 本文研究替格瑞洛对氧化型低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL）诱导血管内皮细胞损伤的保护作用，并探讨p16 基因在替格瑞洛保护内皮功能中的作用及潜在机制。 1 材料和方法 1.1 材料 人内皮素1（endothelin-1，ET-1）elisa 试剂盒（厦门仑昌硕生物科技有限公司）；一氧化氮（nitricoxide，NO）含量检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）；替格瑞洛（阿拉丁公司，中国）；人脐静脉内皮细胞（human umbilical endothelial cell，HUVEC）、EdU 检测试剂盒、RIPA 细胞裂解液、BCA 蛋白定量试剂盒、ECL 底物发光液、无血清冻存液、内皮细胞培养液（苏州君欣生物科技有限公司）；细胞凋亡检测试剂盒（Roche 公司，美国）；Transwell 迁移小室（Corning公司，美国）；TRIzol RNA提取试剂、逆转录试剂和Real-time PCR试剂（江苏康为世纪生物科技有限公司）；抗DNMT1、p16 和β-Actin 抗体（Abcam抗体，美国）；CCK-8 检测试剂盒、基因组DNA 提取试剂盒、Taq DNA 聚合酶、琼脂糖胶（北京天根生化科技有限公司）；EZ DNA Methylation-Gold Kit 甲基化试剂盒（Zymo Research公司，美国）；Lipofectamine 2000（Invitrogen 公司，美国）；胰酶和青霉素/链霉素（Sigma-Aldrich 公司，美国）；全功能酶标仪、细胞培养箱（Thermo公司，美国）；生物安全柜（江苏苏净集团有限公司）；倒置显微镜（Olympus公司，日本）；超高速低温离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司）；超低温冰箱（安徽中科都菱商用电器股份有限公司）；流式细胞仪（Millipore公司，美国）。 1.2 方法 1.2.1 血清ET-1、NO含量测定 采集ACS患者双联（阿司匹林+替格瑞洛或阿司匹林+氯吡格雷）治疗前及治疗后1个月的外周静脉血5 mL，常温下3 000 r/min 离心10 min，收集上清液，-80 ℃冰箱保存。采用ELISA 试剂盒检测血清ET-1的含量，按照NO检测试剂盒的说明书检测NO的含量。研究经南京中医药大学附属医院伦理委员会批准且研究对象知情同意（伦理批准文号：2021NL-130-02）。 1.2.2 HUVEC培养 HUVEC细胞培养于含10%胎牛血清、100 U/mL的青霉素和链霉素的内皮细胞专用培养基，置于含5%CO2的37 ℃细胞培养箱中。隔天换液，于细胞密度80%左右时，胰酶消化传代、种植细胞。 1.2.3 基因过表达、敲除与细胞转染 p16 过表达构建于慢病毒载体pcDNA-EGFP。p16 DNA 片段从HEK293 的cDNA 中通过PCR 扩增获取。PCR 的反应体系如下：2 μL cDNA；10 μL 2×qPCR mixture；1 μL 上下游引物（10 μmol/L）；6 μL无菌蒸馏水。real-time PCR 的反应程序如下：预变性，95 ℃，5 min；变性，95 ℃，5 s；退火，56 ℃，30 s；延伸，72 ℃，30 s；40 个循环。PCR 引物采购于上海捷瑞生物工程有限公司。p16：正义5＇-CCGGAATTCATGGGTCGCAGGTTCTTGG-3＇，反义5＇-CGCGGATCC-CTATGCCCGTCGGTCTGG-3＇。PCR产物连接到带有EcoRⅠ和BamHⅠ位点的pcDNAEGFP载体中。 针对DNMT1 和p16 的特定短发夹RNA（shDNMT1和shp16）与对照短发夹RNA（shNC）由上海