实验室细胞培养基本知识专题培训课件.ppt

细胞培养基本概念;有限细胞系与连续细胞系：正常细胞通常只能分裂有限的次数，随后就会丧失增殖的能力，这是一个由遗传决定的事件，被称为衰老；这种只能分裂有限的次数的细胞系被称为有限细胞系。但是，一些细胞系会通过“转化”的过程变为永生性细胞系，这一过程可自然发生，也可经化学或病毒诱导发生。有限细胞系发生转化获得无限分裂能力后，就成为连续细胞系。 培养条件：细胞培养的人工环境必须包括合适的容器，容器中含有一定的基质或介质，为细胞提供必需的营养素 (氨基酸、碳水化合物、维生素、矿物质)、生长因子、激素和气体 (O2、CO2)，并可调节其物理化学环境 (pH、渗透压、温度)。;为什么要细胞培养？;细胞培养的应用;细胞培养实验室;细胞培养设备;细胞培养通风橱通过维持工作区域上方稳定、单向的HEPA过滤空气流动，保护工作环境免受灰尘及其他空气污染物污染。;准备与灭菌;灭菌方式的选择;灭菌方式的选择;玻璃器皿、金属器皿的清洗和灭菌;塑料制品的清洗和灭菌;水的制备和灭菌;PBS的制备;配置完全培养基;无菌操作技术;无菌操作技术;无菌工作区域——洁净台的使用;在通风橱中部开阔区域放置细胞培养容器 移液器置于右前方易于取用的地方 试剂和培养基置于右后方，便于吸取 试管架置于中后部，用于固定其他试剂 小型容器置于左后部，用于盛放废液;良好的个人卫生;外来试剂、培养基和培养物的无菌;细胞培养箱的无菌;细胞培养中的无菌操作;细胞培养中的无菌操作;小结;污染;酵母：培养物被酵母污染后也会变得浑浊， 但pH 值变化极小，污染严重时 pH 值才会升高。在显微镜下，酵母呈单个卵圆形或球形颗粒，有些会芽生出较小的颗粒。图为293细胞被酵母污染。;支原体：是一种没有细胞壁的简单细菌，被认为是能够自我复制的最小的生物。由于体积极小 (一般小于 1 微米)，支原体的检测十分困难。可在培养物中持续存在造成慢性支原体感染，而不会导致细胞死亡，表现为：细胞增殖速度降低、饱和密度下降以及悬浮培养物凝集；;抗生素的使用;细胞培养基本知识—获取细胞;培养环境;血清：是基础培养基中极为重要的细胞生长和粘???因子、激素、脂质和矿物质来源。此外，血清还可调节细胞膜通透性，并可作为向细胞内运送脂质、酶、微量营养素和微量元素的载体。但是，在培养基中添加血清也有一些缺点，包括：成本高，存在标准化、特异性和变异性问题，具有一些不良效应，如：可促进或抑制某些细胞的生长或功能。 pH 值：大多数正常的哺乳动物细胞系都能在 pH 值为 7.4 的环境中生长良好，而且不同细胞株间差异极小。但是，目前发现有些转化细胞系在轻度偏酸性的环境 (pH 7.0–7.4) 中生长较好，而有些正常的成纤维细胞系更适合轻度偏碱性的环境 (pH 7.4–7.7)。可通过添加有机缓冲盐 (例如：HEPES) 或者二氧化碳-碳酸氢盐缓冲盐来缓冲 细胞培养中的pH 值变化。 二氧化碳：通常使用浓度为 5% 的二氧化碳来控制培养体系的 pH 值，大多数细胞二氧化碳浓度在4–10%之间。 温度：大多数人和哺乳动物细胞系在 36℃至 37℃下具有最佳生长状态。禽类细胞系在 38.5°C 时具有最佳生长状态。虽然此类细胞也可在 37°C 下培养，但其生长速度会变慢。;补充：CO2使用中的问题;培养细胞的形态;培养细胞的形态;换液;换液步骤;传代;传代步骤;传代步骤;细胞的冻存;冻存步骤;冻存细胞使用管理;细胞转染基本知识;什么是转染？为什么要做转染实验？;转 染 技 术 的 分 类;瞬 时 转 染;稳 定 转 染;;病毒介导的稳定细胞株构建;影响转染效率的因素有很多，细胞株本身的特性和活性，细胞培养条件，转染的DNA或RNA的质量，转染方法，转染试剂的选择等。 我们在实验中最常用的方法是脂质体转染，利用脂质体转染法最重要的就是减小脂质体的毒性，因此脂质体与质粒的比例，细胞密度以及转染时间的长短和培养基中血清的含量都是影响转染效率的重要因素，通过实验摸索的合适转染条件对于转染效率的提高有巨大的作用。 ? ;影 响 转 染 效 率 的 因 素;转 染 试 剂;细 胞 状 态;细 胞 密 度;血 清;抗 生 素;D N A 质 量;载 体 构 建;主 流 转 染 试 剂 推 荐细胞培养基本概念;有限细胞系与连续细胞系：正常细胞通常只能分裂有限的次数，随后就会丧失增殖的能力，这是一个由遗传决定的事件，被称为衰老；这种只能分裂有限的次数的细胞系被称为有限细胞系。但是，一些细胞系会通过“转化”的过程变为永生性细胞系，这一过程可自然发生，也可经化学或病毒诱导发生。有限细胞系发生转化获得无限分裂能力后，就成为连续细胞系。 培养条件：细胞培养的人工环境必须包括合适的容器，容器中含有一定的基质或介质，为细胞提供必需的营养素 (氨基酸、碳水化合物、维