1株新型鸭呼肠孤病毒(SL株)的全基因组测定分析及其致病性.docx

? ? 1株新型鸭呼肠孤病毒(SL株)的全基因组测定分析及其致病性 ? ? 杨晓伟,陆 婧，王凯民，庄鸿琨，田宇森，李俊锋，朱盈名，刘 霞，张立武，赵光伟, * (1.西南大学 动物医学院，重庆 荣昌 402460；2.南京海关动植物与食品检测中心，江苏 南京，210095;3 贵州省动物疫病预防控制中心，贵州 贵阳550008；4.重庆三杰众鑫生物工程有限公司，重庆 荣昌 402460) 禽呼肠孤病毒(avian reovirus,ARV)是呼肠孤病毒科、正呼肠孤病毒属的成员。鸭源呼肠孤病毒是其中的一种，目前主要有2种基因型，一种是番鸭呼肠孤病毒(muscovy duck reovirus,MDRV)，主要引起番鸭、半番鸭肝脏、脾脏坏死，肾脏出血等病理变化，俗称“花肝病”或“肝白点病”；另一种则是引起麻鸭、番鸭、北京鸭、樱桃谷鸭等多品种鸭以脾脏斑块样坏死为特征的“脾坏死病”，该病的病原为新型鸭呼肠孤病毒(novel duck reovirus,NDRV)，可通过垂直和水平2种方式传播，发病鸭病死率达到5%～50%，日龄越小病死率越高，无明显的季节性，已经成为我国近年来最严重的鸭病毒性传染病之一[1]。 NDRV与其他禽源呼肠孤病毒均为呼肠孤病毒科、正呼肠孤病毒属的成员，为分节段的双链RNA病毒[2]。病毒粒子无囊膜，约为70 nm，呈24面体对称，具有双层衣壳结构，病毒基因组由10个基因组片段组成，根据基因组在PGAE电泳中的迁移率不同，可分为3个长片段(L1、L2、L3)，3个中片段(M1、M2、M3)和4个小片段(S1、S2、S3、S4)[3]。除了S1片段以外其他的基因片段均只含有1个开放阅读框，分别编码1种蛋白，L组编码λ蛋白(λ1、λ2、λ3)，M组编码μ蛋白(μ1、μ2、μ3)，S组S2、S3、S4分别编码σA、σB、 σNS蛋白，S1基因片段具有多顺反子结构，包含3个重叠的开放阅读框并编码σC、P10、P17蛋白[4]。NDRV S1片段的多顺反子结构与MDRV差异较大，且MDRV的p10和σC蛋白由最小的基因组节段S4编码，并且不编码p17蛋白，因此NDRV 在基因组序列上与其他禽源呼肠孤病毒存在较大差异[5]。 近年来，我国川渝地区鸭场中多发以肝脏、脾脏出血、坏死为主要特征的传染性疾病，病死率达30%，其特征与NDRV病相似。因此，为明确该病的致病原及其分子特征，本试验对四川省隆昌地区的患病鸭进行了病毒的分离、鉴定与全基因组的测定分析，以期为该病的防控提供必要的理论支撑。 1 材料与方法 1.1 病毒的分离无菌采集四川省隆昌某鸭场5只具有典型脾脏坏死的花边鸭病料(肝脏和脾脏)，剪碎混匀，加入无菌PBS液研磨为匀浆液，于-20℃ 和4℃反复冻融3次，12 000 r/min离心15 min 取上清液，用孔径为0.22 μm的一次性滤芯过滤除菌，将滤液经尿囊腔按0.2 mL/枚接种11日龄SPF鸭胚8枚，同时设置8枚作为对照组注射等量无菌生理盐水，用蜡封孔，37℃静置孵育。将接种病料后24～120 h内死亡的鸭胚和对照组鸭胚于4℃冷藏2 h后收集尿囊液，将收集的尿囊液按1∶10的比例加入氯仿后12 000 r/min离心取上清，同样用0.22 μm滤芯过滤除菌后分装于-80℃保存，将其命名为F1代。将F1代尿囊液按照同样的方法接种于一批新的SPF鸭胚，依次传代(标记为Fn)，直到感染鸭胚出现规律性死亡，剖解死亡鸭胚并记录病理变化。 1.2 病原的RT-PCR鉴定参考相关文献[6]，根据NDRV S1基因序列的保守区域设计合成1对特异性引物，上游F：5′-TGAGACGCCTGACTACGA-TT-3′，下游R：5′-ATGCTTGGAGTGAGACGA-CT-3′，预期扩增片段大小为380 bp，引物由华大基因科技公司合成。取1.1保存的组织匀浆液和尿囊液，分别用EasyPure Viral DNA/ RNA提取试剂盒(ER201-01，北京全式金)提取其总RNA并反转录为cDNA，按如下体系和条件进行扩增。PCR反应体系(25.0 μL)：模板3 μL，10 pmol/L上、下游引物各1.0 μL，Premix Taq 12.5 μL，无菌ddH2O 7.5 μL。PCR扩增程序：94℃预变性5 min；94℃ 40 s，55℃ 40 s，72℃ 45 s，共33个循环；72℃延伸10 min，4℃保存，将PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测后回收目的片段，送华大基因科技有限公司进行测序。 1.3 全基因组序列的测定病毒全基因组的测定由上海凌恩生物科技有限公司完成。其主要步骤为：取1.1中保存的尿囊液提取总RNA，利用紫外分光光度计检测其纯度，使其D260/D280值在1.8～2.0之间以制备测