重组质粒的构建、转化与重组子筛选.docVIP

重组质粒的构建、转化与重组子筛选 【实验目的】 1、 学习掌握限制性内切酶的分类、特性和作用原理; 2、 学习在实现DNA的体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性核酸内切酶，并利用限制性核酸内切酶对载体和目的DNA进行切割，产生利于连接的合适末端。通过对DNA的酶切，学会设计构建重组DNA分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作技术; 3、 学习利用T4 DNA连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA片段连接起来，构建体外重组DNA分子的技术，了解并掌握几种常见的连接方法; 4、 掌握利用 CaCl2制备感受态细胞的方法; 5、 学习和掌握热激法转化E.coli的原理和方法; 6、 掌握α-互补筛选法的原理; 7、 学习用试剂盒提取质粒DNA的方法; 8、 学习和掌握利用琼脂糖凝胶电泳筛选重组质粒; 9、 学习掌握重组子DNA分子鉴定的基本方法。 【实验原理】 1、体外构建重组DNA分子，首先，要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性内切酶不能目的基因内部有专一的识别位点，即当用一种或两种限制性核酸内切酶切割外源供体DNA时，能得到完整的目的基因。其次，要选择具有相应的单一酶切位点的质粒或者噬菌体等载体分子作为克隆的载体。常用的酶切方法有双酶切法和单酶切法两种。 2、单酶切法，即只能用一种限制性核酸内切酶切割目的DNA片段，酶切后的片段两端将产生