细胞融合实验报告_2.doc

聚乙二醇介导的细胞融合 2012年2月19星期一 陈倩倩（118627140313）同作者：郑梦璐 谢雨后 赵松 1、文摘 细胞能不受种属的局限可实现种间生物体细胞的融合,使远缘杂交成为可能,因而是改造细胞遗传物质的有力手段。它的意义在于从此打破了仅仅依赖有性杂交重组基因创造新种的界限,扩大了遗传物质的重组范围。 但融合后获得的杂种细胞具有染色体异倍性,致使细胞株的遗传性不稳定、植株不育性、畸形、生育迟缓等不符合育种要求的性状出现,直接利用杂种细胞作育种材料目前还有许多障碍。 细胞融合技术避免了分离、提纯、剪切、拼接等基因操作,在技术和仪器设备上的要求不像基因工程那样复杂,投资少,有利于广泛开展研究和推广,有着重大的实践意义,正得到科学界的日益重视。 自从20世纪70年代Kao和Michayluk用聚乙二醇( PEG, polyethyleneglycol) 诱导大麦、大豆等植物原生质体融合后PEG法诱导细胞融合以其容易制备、活性稳定、不需要特别的仪器设备、操作简便等优点, 被普遍地应用于生物、遗传、医药等研究领域. 高体积分数、高相对分子质量的PEG会对细胞产生毒性, 是限制其被广泛应用的瓶颈, 此外,由于该方法涉及的影响因素较多, 进一步加大了获得理想细胞融合率的难度.本实验主要研究PEG的浓度和细胞浓度对细胞融合率的影响。 2、背景介绍 细胞融合现象最初是在动物细胞中发现的。1958年日本学者阅田善雄用紫外光灭活的仙台病毒在体外诱导艾氏腹水红纲胞相互融合。1965年他和Harris等在此基础上各自分别采用灭活的仙台病毒,诱导产主了第一个种间融合并培养成活。一年后Yerganzan又进一步使用仙台病毒获得了能够增殖的杂种细胞。后来Littlefield 用缺陷型细胞HGPRT-XTK-细胞杂交,用HAT 选择培养基选出杂种细胞,开创了细胞工程的新纪元,继而推动了整个生物工程的发展。1975年英国科学家Milestein 和Kohler在体细胞杂交基础上创立了B淋巴细胞杂交瘤技术,他们将在体外不能长期生存的经绵羊红细胞免疫过的小鼠脾细胞（B淋巴细胞）与在体外能迅速增殖的小鼠骨髓溜细胞在聚乙二醇（PEG）或汕台病毒的作用下融合而产生杂交瘤细胞,所得杂交瘤细咆承袭了两种亲代细胞的遗传特性,既保存了瘤细胞在体外迅速增殖传代的能力,又继承了免疫细胞合成和分泌的能力,即能分泌抗绵羊红细胞的抗体。该技术被誉为免疫学的一次革命其创建者荣获1984年诺贝尔医学和生理学奖。 B细胞杂交瘤可在体外大量培养,也可接种到小鼠腹腔中繁殖。自1975年以来,世界各国科学家采用B细胞杂交瘤技术已制备出万余种单抗,其中绝大部分为小鼠墓抗。所谓单抗就是指培养单个杂交瘤细胞使之无性生殖形成细胞集落（称为克隆）,由这些细胞所产生的只能识别和对付一种抗原的特导性抗体就称为单克隆抗体,即单抗。 单抗于八十年代处已领尤商品化，现已有百余种诊断试剂和数种治疗剂投放市场。目前,单抗新兴产业正在形成。随着B淋巴细胞杂交瘤技术的建立和发展,B淋巴细抱杂交瘤技术也发展起来了。 早在1977年就有T细胞杂交瘤的报道,但有功能的、能分泌各种因子的T细胞杂交瘤的报道则始于1978年,如抗原特异的抑制因子,制造T细胞杂交瘤技术的基本操作过程和B细咆杂交瘤技术相似,只是用于融合的细胞是激活或抗原致敏的T 细胞和酶缺陷型的淋巴瘤细胞。目前,由于技术上的限制,T 细胞杂交瘤还未能发挥其固有的潜能,所以,虽然这项技术开展的时间不短,但收到的成效却不如B细胞杂交瘤那么显著. 最近研究表明,细胞融合与病毒和细胞之间的融合以及细胞内的膜泡融合有许多相似之处, 即带包被的病毒( 或细胞) 通过转膜病毒蛋白介导与宿主细胞的细胞膜进行融合。I 类病毒融合蛋白包括流感病毒红血球凝集素( HA) 和人类免疫缺陷病毒包被蛋白,它们都具有相似的结构域, 即都具有a- 螺旋结构。病毒和细胞之间正是通过这些蛋白来完成融合过程( 伴随有构象的变化) 的。细胞内的膜泡融合也是如此, 其相关融合蛋白包括GTPases 及SNARE家族。因此推测细胞融合采用相似的机理。然而细胞融合蛋白并不全具有a- 螺旋结构, 提示a- 螺旋并非融合所必需。 3、材料和方法 3.1材料 用Alsver液悬浮的鸡血细胞 Alsver溶液， 0.85% 的生理盐水， GKN溶液， 50% 的聚乙二醇溶液 3.2工具和仪器 盖玻片，载玻片，离心管，试管，吸管，显微镜，离心机 3.3实验步骤 1.向1 ml血细胞悬液中加入 4 ml 0.85% 生理盐水，清洗细胞， 1000-1200 r/min离心5min。弃上清。 2. 重复第一步一到两次 。 3. 细胞沉淀中加GKN溶液至 2 ml ，混匀。 4. 加0.5ml的混合液到 1.5