植物细胞器的分离.docx

. . . . 植物细胞器的分离 一、叶绿体的分离： 实验原理： 采用差速离心法，利用不同颗粒的大小形状不同导致沉降速率不同，把叶 绿体的颗粒沉降出来。 实验材料及试剂： 成熟的猪笼草 、山梨醇、Tris、EDTA 与 β-巯基乙醇均为 Amresco 产品、 细胞器分离缓冲液:300 mmol/L 山梨醇, 50mmol/L Tris-HCl(pH 为 8.0), 5 mmol/L EDTA(pH 8.0), 0.1%β-巯基乙醇(临用前加入)。 实验器材： SG350C 多功能食品料理机(上海天航电器有限公司) , GL21M 高速冷冻离心 机及配套的 2 号角转头(湘仪集团) 名称使用浓度 名称 使用浓度 配制体 从母液 积 吸取体 母液浓度 称取 g 实际 g 母液体 积 备注 0.05mol/L Tris-HCl 0.05mol/L EDTA 0.005 mol/L β-巯基乙 0.1% 醇 蔗糖蔗糖 EDTA EDTA 52% 30% 0.025 mol/L 0.025 mol/L 积 山梨醇 0.3 mol/L 100ml 10ml 3mol/L 54.651 100mL 100ml pH 8.0 100ml 1ml 0.5mol/L 14.6124 100mL pH 8.0 100ml 100ml 0.1% 0.1 100ml 100ml 100ml 52% 52 100ml 100ml 100ml 30% 30 100ml 100ml 100ml 2.5mol/L 73.062 100mL pH 8.8 100ml 100ml 2.5mol/L 73.062 100mL pH 8.0 计算过程： 山梨醇：配制体积：100 mL，浓度：3 mol/L；分子量：182.17g/mol 需 要 称 取 质 量 g:=100 mL*3 mol/L*182.17g/mol=0.1L*3 mol/L*182.17g/mol=54.651g EDTA: 配置体积：100ml , 浓度：0.5mol/lL ,分子量：292.248g/mol m= 0.5mol/L *100mL *292.248g/mol =14.6124 g LEDTA : 配置体积:100ml 浓度：25mol/L ,分子量：292.248g/mol m=2.5mol/L*100mL * 292.248g/mol=73.062g 制备方法 叶绿体粗提物的制备 （1）. 取 25 g 叶片置于 100 mL 充分预冷的细胞器分离缓冲液中,用食品料理 机匀浆 2 min(5000r/min), （2）. 然后将匀浆液用 4 层纱布过滤于 500ml 烧杯, （3）. 滤液于 4℃、700g 在 1000r/min 离心 10 min, （4）.弃去细胞核沉淀上清液再于 4℃、2 000 g 在 3000r/min 离心 10min,所得沉淀即为叶绿体粗提物, （5）.将此粗提物悬浮于 7.5 mL 细胞器分离缓冲液中备用。 密度梯度离心制备完整叶绿体 （1）.用 50 mL 离心管制备蔗糖梯度,底部为 18 mL 含 52%(质量分数)的蔗 糖,50 mmol/L Tris-HCl(pH 为 8.8),25 mmol/L EDTA(pH 为 8.8)的混合液, 上面用 7 mL 含 30%蔗糖、50 mmol/L Tris-HCl(pH 为 8.0)、25 mmol/L EDTA(pH 为 8.0)的混合液覆盖。 （2）. 将上述所得叶绿体粗提取物小心覆盖于 30%的蔗糖上面,平衡后在 4℃、 20 kr/min 离心 30 min。 （3）.处于 52%蔗糖与 30%蔗糖界面上的绿色条带即为完整叶绿体。 （4）.用加样枪小心吸出绿色的条带。 叶绿体的显微鉴别： 叶肉细胞中的叶绿体，散布于细胞质基质中，呈绿色，扁平的椭球形或球 形可以在高倍显微镜（400~600）下观察到它的形态和分布。 二、线粒体的分离 实验原理： 利用沉降系数不同的颗粒，在一定介质中沉降速度的差异，采取分级差速 离心的方法，将线粒体从细胞悬液中逐级分离出来。 实验材料及试剂： 实验材料成熟的拟南芥，琼脂糖为杭州微生物试剂厂产品;牛血清蛋白(BSA) 为上海试剂厂产品;DNase 和 RNase 为上海生物工程技术服务有限公司产品; 溴化乙锭为 SerVa 公司产品;其余试剂均为国产分析纯.1×TAE 电泳缓冲液(称取 242 g Tris 溶于适量蒸馏水中,加入 57. 1 mL 冰乙酸, 100 mL 0.5mol·L1EDTA,pH= 8. 0,用蒸馏水定容至 1 L 即为 50×TAE 转换为 1 ×TAE 稀 50 倍)缓冲液 A:蔗糖 0. 5 mol·L-1, Tris-Cl