海藻糖生产菌的筛选.docxVIP

海藻糖生产菌的筛选 海藻糖是指由两个葡萄糖残基-1和1糖苷键组成的非还原双糖。它对食品和医学研究中的医药行业和医药行业都有广泛的用途。近年来,有关极端环境下生活的古细菌中酶法合成海藻糖的研究很活跃。1995年Maruta K.等人从古细菌Arthrobactersp.Q36分离了海藻糖合成相关的两个酶的基因。1996年Kobaysahi K.等人从硫化硫矿叶菌(Sulfoblbus solfataricusKM1)中分离了与海藻糖合成相关的两个酶的基因并在大肠杆菌中得到了表达。极端环境下生活的古细菌,嗜热嗜酸、生长缓慢、难于培养,产酶活力低,不适合工业生产;而基因工程菌株可在常温培养、生长快,产酶活力高,重组酶与原始菌株的酶具有同样好的性能,故很有工业应用前景。为了使酶法生产海藻糖工业化,本室已将古细菌芝田硫化叶菌中与海藻糖合成相关酶MTSase及MTHase的基因克隆并在大肠杆菌中实现了表达。其中MTHase也称为新型α-淀粉酶,是内切型淀粉酶,很象α-淀粉酶,但具有完全不同于其它α-淀粉酶的底物特异性和水解方式。该酶专一水解麦芽寡糖基海藻糖的麦芽寡糖基和海藻糖基间的α-1,4葡萄糖苷键,得到海藻糖和比相应底物少两个葡萄糖单位的麦芽寡糖。其反应式如下: 麦芽寡糖?→??MTSase→ΜΤSase麦芽寡糖基海藻糖 麦芽寡糖基海藻糖?→???MTHase→ΜΤΗase麦芽寡糖(比初始底物少两个葡萄糖基)+海藻糖 为了提高该基因工程菌株中新型α-淀粉酶的表达水平,提高其酶活力,我们对影响新型α-淀粉酶基因工程菌表达条件进行了探讨和研究。 1 材料和方法 1.1 菌株本室保存 重组质粒pSBAM,基因工程株ESBAM本室构建保存,受体菌E.coli的DH5α,XL1-Blue,TG1,JM109,HB101等菌株本室保存。 1.2 配方推导的筛选 LB、M9、LB+、RM培养基的配方参见文献。LB+为改进的LB,NaCl的量减少到原来的一半,蛋白胨采用国产(上海东风制剂厂)产品。 1.3 仪器和试剂 薄层层析扫描仪(CS-930)为日本岛津公司产品,721分光光度计(上海),超声波细胞破碎仪(上海),其余试剂为国产分析纯。 1.4 sds-东南角菌体的制备 将-70℃保存的ESBAM菌株活化3次后,在LB/Ampr平板上划线,取一单菌落接到5mlLB培养基(含Amp 100μg/ml),30℃摇荡过夜,当把种子液以1%的接种量转到50ml到培养基(含Amp 100μg/ml),30℃摇荡培养,当菌体密度OD600为0～1.5时,立即转到36～45℃,诱导1～7小时,然后,分别在不同的条件下,取1ml菌液,离心收集菌体,用于SDS分析目的基因的表达水平。其余的菌液在4℃,6000×g ,离心10min收集菌体,并将菌体悬浮于50mmol/L PH6.0的PBS。 1.5 制备：粗酶溶液 将悬浮于PBS缓冲液的菌体进行超声波破碎30s×10次,4℃,20min,10000×g离心,收集上清液,为粗酶液。 1.6 微量比色法测定 新型α-淀粉酶酶活力测定方法:采用改进的FuWa方法实验室微量比色法测定。一个酶活力单位定义为60℃下1分钟液化0.1mg可溶性淀粉所需的酶量。以下均用按上述方法制备的粗酶液测定基因工程菌ESBAM的酶活力。 1.7 追求蛋白的总蛋白 基因工程菌株ESBAM目的蛋白表达量的测定用常规的SDS分析,用日本岛津公司生产的薄层层析扫描仪CS-930扫描,即可得到目的蛋白占全部菌体可溶性总蛋白的百分率。 2 esbam表达条件的优化 2.1 重组质粒psbam的诱导表达 把本室构建的重组质粒pSBAM用快速的CaCl2法分别转化到大肠杆菌的不同的菌株DH5α,XL1-Blue,TG1,JM109,HB101中,30℃培养到OD600为0.6,在41℃下诱导3小时,10% SDS结果及酶活测定结果表明,重组质粒 pSBAM在所选择的大肠杆菌五种不同的宿主菌中目的蛋白的表达有差别,DH5α中(酶活力略高(图1),61KD的目的蛋白占菌体总蛋白18.2%,酶活力为12.9U/ml。以后的条件优化中选择表达量较高的DH5α作为基因工程菌株受体菌的出发菌株。 2.2 菌种表达的目的蛋白 选择LB,M9,LB+,RM四种常用培养基,分别接种上述工程菌种,在相同的诱导条件下,结果见图1,在改进的LB+培养基中表达的目的蛋白占菌体总蛋白的20.1%,酶活力为19.1U/ml。说明该基因工程菌在改进的LB+培养基中的表达量最高(图1)。 2.3 不同诱导时间诱导的蛋白表达 在确定了工程菌的受体菌和培养基后,我们对基因工程菌的诱导时间做了研究。在41℃下,分别诱导1,2,3,4,5,6,7小时,发现从诱导1小时开始出现目的蛋白,随着诱导时