淀粉酶活性测定实验标准报告.docVIP

酶活力测定方法的研究 一．研究背景及目的 酶是高效催化有机体新陈代谢各步反应的活性蛋白，几乎所有的生化反应都离不开酶的催化，所以酶在生物体内扮演着极其重要的角色，因此对酶的研究有着非常重要的意义。酶的活力是酶的重要参数，反映的是酶的催化能力，因此测定酶活力是研究酶的基础。酶活力由酶活力单位表征，通过计算适宜条件下一定时间内一定量的酶催化生成产物的量得到。本实验选取萌发的禾谷类种子为材料，通过对其所含两种淀粉酶活力的测定来研究酶活力测定的方法。 实验原理 萌发的种子中存在两种淀粉酶，分别是α淀粉酶和β淀粉酶，β淀粉酶不耐热，在高温下易钝化，而α淀粉酶不耐酸，在pH3.6下则发生钝化[1]。本实验的设计利用β淀粉酶不耐热的特性，在高温下（70℃）下处理使得β淀粉酶钝化而测定α淀粉酶的酶活性[1]。酶活性的测定是通过测定一定量的酶在一定时间内催化得到的麦芽糖的量来实现的，麦芽糖的浓度利用比色法可以很容易测得。然后利用同样的原理测得两种淀粉酶的总活性，拟将总活性与α淀粉酶的活性的差值看作β淀粉酶的活性，再做进一步分析。实验中为了消除非酶促反应引起的麦芽糖的生成带来的误差，每组实验都做了相应的对照实验，在最终计算酶的活性时以测量组的值减去对照组的值加以校正。 材料、试剂与仪器 材料： 萌发的小麦种子 试剂： ① 1%淀粉溶液（称取1克可溶性淀粉，加入80ml蒸馏水，加热熔解，冷却后定容至100ml）； ② pH5.6的柠檬缓冲液：A液（称取柠檬酸20.01克，溶解后定容至1L） B液（称取柠檬酸钠29.41克，溶解后定容至1L）取A液5.5ml、B液14.5ml混匀即可； ③ 3，5-二硝基水杨酸溶液（称取3，5-二硝基水杨酸1.00克，溶于20ml 1M氢氧化钠中，加入50ml蒸馏水，再加入30克酒石酸钠，待溶解后，用蒸馏水稀释至100ml，盖紧瓶盖保存）； ④ 麦芽糖标准液（称取0.100克麦芽糖，溶于少量蒸馏水中，小心移入100ml容量瓶中定容）； ⑤ 0.4M NaOH 仪器： 722光栅分光光度计(编号990695) DK-S24型电热恒温水浴锅(编号L-304056) 离心机(TDL-40B) 配平天平 药物天平 电热锅 100ml容量瓶 50ml容量瓶 移液管 试管 研钵 烧杯 洗瓶 实验方法 本实验按照下列表格的中的操作步骤进行： 1.酶液的制备 ① 称取2克萌发的小麦种子与研钵中，加少量石英砂，研磨至匀浆。 ② 转移到50ml容量瓶至40ml，浸提15-20min，定容。 ③ 混匀后于3500rpm离心20min，取上清液待用。 2.α淀粉酶活性的测定 ① 取4支管，注明2支为对照管，另2支为测定管 ② 各管酶液1ml，70 ③ 各管加入1ml柠檬酸缓冲液 ④ 40℃ ⑤ 对照管加入4ml 0.4M NaOH ⑥ 各管加入40℃预热的淀粉溶液2ml，摇匀立即放入40 ⑦ 取出后向测定管加4ml 0.4M NaOH 3.两种淀粉酶总活性的测定 ① 取酶液5ml于100ml容量瓶，定容，摇匀 ② 取4支管，注明2支为对照管，另2支为测定管 ③ 各管加入1ml稀释后的酶液 ④ 按照步骤2中③—⑦操作 4.标准曲线的制备 样品的测定 ① 取具塞试管7支，编号，加麦芽糖标准液（1mg/ml)0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.0毫升，蒸馏水补充至1.0ml，摇匀 ① 取具塞试管8支，编号，分别加入步骤2和3中各管的溶液各1ml ② 加3，5-二硝基水杨酸1ml，摇匀 ③ 沸水浴中准确加热5min，取出冰浴冷却 ④ 蒸馏水稀释至15ml，摇匀 ⑤ 用分光光度计于520nm下比色，记录消光值 数据整理 麦芽糖标准液浓度mg/ml 0 0.1 0.3 0.5 0.7 0.9 1.0 OD520 0.000 0.025 0.180 0.335 0.459 0.634 0.686 项目 α(测) α(测) α(对) α(对) α+β(测) α+β(测) α+β(对) α+β(对) OD520 0.436 0.415 0.238 0.242 0.215 0.211 0.010 0.014 麦芽糖浓度mg/ml 0.641 0.610 0.350 0.356 0.316 0.310 0.015 0.021 平行组数据均值 mg/ml 0.626 0.353 0.313 0.018 上表中前4行数据为实验的原始数据。以表中前两行数据绘制标准曲线（见下页），根据标准曲线的方程，计算上表中第4行数据（各样品的OD值）所对应的麦芽糖浓度，填入上第5行中，计算两组平行实验所测麦芽糖浓度的平均值，填入最后一行，如上表。 结果计算与讨论分