Autophagy分析和总结内容.docxVIP

【专题讨论】Autophagy（自噬） 自噬的研究方法： 正常培养的细胞自噬活性很低，不适于观察，因此，必须对 自噬进行人工干预和调节，经报道的工具药有： （一）自噬诱导剂 Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin ：模拟内质网应激 Carbamazepine/ L-690，330/ Lithium Chloride（氯化锂）： IMPase 抑制剂（即 Inositol monophosphatase，肌醇单磷酸酶） 3）Earles 平衡盐溶液：制造饥饿 4）N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3K Pathway 抑制剂 5）Rapamycin：mTOR 抑制剂6）Xestospongin B/C：IP3R 阻滞剂 （二）自噬抑制剂 1）3-Methyladenine（3-MA）：（Class III PI3K） hVps34 抑制剂 2）Bafilomycin A1：质子泵抑制剂3）Hydroxychloroquine（羟氯喹）：Lysosomal lumen alkalizer （溶酶体腔碱化剂）除了选用上述工具药外，一般还需结合 遗传学技术对自噬相关基因进行干预：包括反义 RNA 干扰 技术（Knockdown）、突变株筛选、外源基因导入等。细胞经诱导或抑制后，需对自噬过程进行观察和检测，常用的策略和技术有： 1）观察自噬体的形成 由于自噬体属于亚细胞结构，普通光镜下看不到，因此，直 接观察自噬体需在透射电镜下。Phagophore 的特征为：新月状或杯状，双层或多层膜，有包绕胞浆成分的趋势。自噬体 （AV1）的特征为：双层或多层膜的液泡状结构，内含胞浆成分，如线粒体、内质网、核糖体等。自噬溶酶体（AV2） 的特征为：单层膜，胞浆成分已降解。（autophagic vacuole， AV）2）在荧光显微镜下采用 GFP-LC3 融合蛋白来示踪自噬形成： 由于电镜耗时长，不利于监测（Monitoring）自噬形成，人 们利用 LC3 在自噬形成过程中发生聚集的现象开发出了此技术。无自噬时，GFP-LC3 融合蛋白弥散在胞浆中；自噬形成时，GFP-LC3 融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬 体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。3）利用 Western Blot 检测 LC3-II/I 比值的变化以评价自噬形成： 自噬形成时，胞浆型 LC3（即 LC3-I）会酶解掉一小段多肽， 转变为（自噬体）膜型（即LC3-II），因此，LC3-II/I 比值的大小可估计自噬水平的高低。 （Note：LC3 抗体对 LC3-II 有更高的亲和力，会造成假阳性。方法 2 和 3 需结合使用，同时需考虑溶酶体活性的影响。）4） 检测长寿蛋白的批量降解：非特异 5）MDC （Monodansylcadaverine，单丹磺酰尸胺）染色：包括自噬体， 所有酸性液泡都被染色，故属于非特异性的。6） CellTrackerTM Green 染色：主要用于双染色，但其能染所有的液泡，故也属于非特异性的。在研究自噬相关蛋白时，需对其进行定位。由于自噬体与溶酶体、线粒体、内质网、高尔基体关系密切，为了区别，常用到一些示踪蛋白在荧光显微镜下来共定位： Lamp-2：溶酶体膜蛋白，可用于监测自噬体与溶酶体融合。LysoTrackerTM 探针：有红或蓝色可选，显示所有酸性液泡。pDsRed2-mito：载体，转染后表达一个融合蛋白（红色荧光蛋白+线粒体基质定位信号），可用来检测线粒体被自噬掉的程度（Mitophagy）。 MitoTraker 探针：特异性显示活的线粒体，荧光在经过固定后 还 能 保 留 。 Hsp60：定位与线粒体基质，细胞死亡时不会被释放。Calreticulin（钙网织蛋白）：内质网腔 【Note：这些蛋白均为胞浆蛋白，爬片或胰酶消化的细胞在做免疫荧光前需先透膜（permeablize），可采用 0.1%SDS 处理】自噬与细胞死亡经常需一起考虑，下面介绍一些检测细 胞死亡的方法： △ψm dissipation（线粒体跨膜电位的消失）：TMRM 发红色荧光，DiOC6（3）发绿色荧光。 Phosphatidylserine Externalization（磷脂酰丝氨酸外翻）： Annexin V-FITC（绿色）染细胞膜，（3）检测线粒体产生的 ROS：无荧光的 HE（hydroethidine，氢化乙啶）可被ROS 氧化为 EthBr（ethidium bromide，溴乙啡啶），发红色荧光。 NAO（nonyl acridi