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穴位电刺激对废用性肌萎缩肌细胞凋亡的影响 在废弃的状态下，骨瘦如长期躺下的患者，四肢骨瘦如长期使用的患者会显著减少。老年人也由于活动的减少,四肢骨骼肌发生明显的萎缩。细胞凋亡可能在老龄化功能丧失过程中起到很重要的作用。细胞凋亡是一种不同于病理性坏死的细胞死亡方式,它是指在活组织中细胞受信号传导的调控,通过主动过程而死亡的现象,是维持细胞增殖与死亡间平衡的重要方式。因此,如何有效地预防和治疗废用性骨骼肌萎缩的研究,目前已成为运动医学研究的热点。本研究采用穴位电刺激的方法,观察其对废用性肌萎缩肌细胞凋亡的干预作用。 1 实验材料 1.1 动物和药物的实验 SD雄性大鼠18只,清洁级,体质量170~230g,12h/12h的昼夜光照,自由进食和饮水。戊巴比妥钠由广州化学试剂厂进口分装。 1.2 精密仪表检测 YXQ-LS-30SII全自动高压蒸汽灭菌器(上海精密仪器仪表有限公司);B3双目摄影生物显微镜(麦克奥迪实业集团公司出产);CM1900型冰冻切片机( Leica);UltraVIEW ERS共聚焦显微镜及图像分析系统(Perkin Elmer);GZX-DH202-4-S型恒温干燥箱(上海精密仪器仪表有限公司);电针用6805-A型电针治疗仪(广东汕头医疗器械厂制造)。 2 实验方法 2.1 不同悬吊方式大鼠的对接 模型组和电刺激组复制肌肉萎缩模型,模型采用Morey-Holton和Globus的悬吊方法,先将大鼠的尾部用75%的医用酒精消毒,在尾部近段2/3的两侧贴敷医用胶布,胶布的末端固定于悬吊笼的金属吊环,调整大鼠身体长轴与悬吊笼水平底部保持30°夹角,金属吊环可以旋转,保证大鼠在笼内可以自由活动,悬吊3周。 2.2 穴位电刺激试验 先按体重分层,再按随机数字表法随机分为3组:对照组、模型组和电刺激组。 其中电刺激组于造模完成后,采用华兴邦动物穴位图谱并结合模拟人体经穴法取足三里穴位,进行穴位电刺激。电针用6805-A型电针治疗仪,电针参数选择频率范围2~15Hz,空载电压20~35V,强度以下肢轻微颤抖为宜,调制脉冲为疏密波,时间30min,1次/天,整个实验周期3周。对照组、模型组不予电刺激。 2.3 鞋肌的固定、冷冻 悬吊3周后,将大鼠处死。迅速分离胫骨前肌,称重,将胫骨前肌在液氮中迅速固定,OCT包埋,然后置于-70℃恒温冷冻冰箱。在冷冻切片机内,连续切片,将肌腹部连续的两片用来做HE染色。 2.4 凋亡核酸标记 每张切片取3个不同部位的切片各2张,以脱氧核苷酸转移酶(TdT酶)介导的荧光的dUTP缺口末端标记法(TdT-mediated fluorescein-dUTP nick end labeling, TUNEL)标记凋亡细胞核DNA3’OH端。主要步骤为:切片常规脱蜡入水,标本片加TBS 1∶200新鲜稀ProteinaseK 37℃消化15min,0.3%H2O2甲醛灭活内源性过氧化物酶(POD)活性,加入TUNEL混合液(含TdT酶及fluorescein-dUTP)37℃孵育1h,加入POD转换液37℃孵育30min, DAB显色,苏木青轻度复染、脱水、透明、封片。正常细胞核呈蓝色,凋亡细胞核呈深浅不一的棕褐色。切片于光镜下200倍放大,经图像分析仪随机选择10个视野,检测阳性表达率(阳性核占视野中总细胞核百分比),作为细胞凋亡指数(apoptosis index,AI)。 2.5 统计处理 全部数据均用单因素方差分析,在SPSS13.0统计软件包中进行处理,结果用均数±标准差(xˉ±sxˉ±s)表示。 3 结果 3.1 肌纤维横截面积比较 肌组织病理观察:肌组织切片经HE染色,镜下观察模型组可见肌纤维横截面积明显减小,电刺激组肌纤维横截面积减小较模型组轻,对照组及电刺激组与模型组比较均存在显著差异。 3.2 凋亡阳性细胞 肌细胞凋亡图像分析:对照组仅见极少量凋亡阳性细胞,模型组肌细胞凋亡明显增多,电刺激组肌细胞凋亡均显著减少,对照组及电刺激组与模型组比较均存在显著差异。 4 气调血,扶本培元针刺法 穴位电刺激调控肢体功能的中医理论基础是“经络内属脏腑,外络于肢节”,因此电刺激一定穴位可影响相应的功能。十二经脉中与肌肉、四肢密切相关的是足阳阴经,其中脾位于腹中,与胃黏膜相连。二者经络上互为络属,构成表里;生理上互相联系,互相依赖,互相协调,分工合作,共同完成消化功能。病理上互相影响,互相传变,所以说脾与胃的关系极为密切。人体肌肉之所以能强壮丰满,四肢活动有力,主要是依靠饮食所化的精气。精气经脾胃传输以达四肢百骸。故脾胃健运则机体肌肉丰满,四肢活动有力。脾胃失运则四肢无力,肌肉消瘦、甚至萎软不用。足三里穴被视为强壮穴,针灸可健脾和胃,扶正培元,通经活络,升降气机。现代研究亦证实益气调血扶本培元针