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单细胞全基因组扩增技术 全基因组扩增技术（wholegenomeamplification,WGA）是一种对全部基因组序列进行非选择性扩增的技术，其目的是在没有序列倾向性的前提下大幅度增加DNA的总量。WGA主要有以下几种类型: 1、DOP-PCR 简并寡核苷酸引物PCR(degenerateoligonucleotideprimedPCR,DOP-PCR)是一种基于PCR技术的全基因扩增方法。 主要原理 使用部分简并寡核苷酸引物进行PCR反应（引物中间含6个随机碱基），首先使用较低的温度（?25°C）进行退火，随后再缓慢升温至引物延伸温度进行引物延伸，完成最初几个循环后，再使用较高的退火温度（?55C）进行多循环常规PCR反应，从而实现对全基因组的扩增。 优点： 操作简单。 产物产量较高 ?起始模板量低时，扩增偏差大。 ?弓物与模板间的不确定性以及弓物间的相互作用均可能导致较低的全扩增灵敏度及较高的错误率。 ?聚合酶及引物浓度需要进行优化。 2、LM-PCR 连接反应介导的PCR(ligationmediatedPRC,LM-PRCR)指的是有接头连接过程参与的PCR反应。 主要步骤模板DNA的片段化处理：物理剪切或限制性内切酶处理使DNA裂解成小片段。 模板片段与接头连接：根据酶切片段类型设计可与之连接的接头，在DNA连接酶的作用下，与模板片段两端连接，接头中含有一段外源通用弓物序列，用作下一步PCR反应中的引物。 全扩增PCR反应：连接成功的模板片段经弓物延伸后两端形成了通用引物结合位点，因此可以外源引入的通用引物进行PCR反应，包括接头在内的模板片段可同时得到扩增。 优点 ?灵敏度高。 ?使用通用引物扩增均匀。 ?产物产量高。 ?对模板DNA质和量要求低。 缺点 ?操作繁琐。 ?多步操作易丢失模板DNA。 3、PEP PEP扩增前引物延伸反应(primerextensionpre-ampification,PEP)是基于PCR技术发展而来的全基因扩增方法。 主要原理 使用随机引物（15个碱基，415种组合）进行PCR反应，首先在37^退火温度下进行退火，随后缓慢升温至55°C进行长时间的引物延伸，如此反复多个循环，从而实现对全基因组的扩增。 优点 ?操作简单，易改进。 ?对模板DNA质和量要求低。 产量低。 ?PCR过程中可能在序列中引入错误和非特异性扩增引物，存在扩增偏差，错误率高。 4、MDA 多重置换扩增(multipledisplacementamplification，MDA)是目前最常用的全基因组扩增方法，该方法通常利用噬菌体Phi29DNA聚合酶和随机引物(硫代磷酸盐修饰过的)来进行扩增。 在恒温30C条件下，随机引物与模板DNA随机退火结合，随后在高保真，强链置换活性的噬菌体Phi29DNA聚合酶作用下，发生链置换扩增反应，被置换产生的单链产物又成为新的复制模板，再进行扩增，如此循环，最后产生大量片段大小为12kb?100kb的扩增产物。 优点 ?不需要特殊仪器。 ?保真性强的扩增能力。 ?扩增产物的量稳定、片段较长。 缺点 ?起始模板量低时，扩增偏差大。 ?对模板质量要求高，可能产生非特异性产物。 5、pWGA 基于弓物酶的全基因组扩增技术(primer-basedwholegenomeamplification,pWGA)是一种恒温全基因组扩增方法，该方法利用噬菌体T7gp4引物酶在模板上合成引物，从而消除了添加合成引物的需求。T7gp4是一种双功能蛋白，既可以用作DNA解旋酶，又可以用作引发酶。 在恒温37°C条件下，噬菌体T7gp4使DNA模板变性并合成引物。随后多位点合成的引物通过DNA聚合酶进行延伸，温育30?120min后，即可实现对模板DNA的扩增。最后在65C下灭活T7gp4酶20min，终止反应。 优点 ?操作简单，不需要使用任何弓物以及对模板进行与变性处理。 ?产量高。 ?对模板质和量要求低。 缺点 ?使用的蛋白(酶)以及试剂较多，保真性稍差。 6、MALBAC 多次退火环状循环扩增技术（multipleannealingandlooping-basedamplificationcycles，MALBAC是基于哈佛大学谢晓亮院士等在2012年研究出的一项专利技术，是目前最先进的全基因组扩增技术。该技术的关键是添加了短的特殊的DNA分子作为引物（含35个核苷酸）。这些引物由两部分组成，其中8个核苷酸的粘性部分变化多样，可与模板DNA随机组合，另27个核苷酸组成一段共同的固定序列，通过将自身掺入到新拷贝链，从而自身成环，防止DNA过度拷贝。 MALBAC技术原理 Annealingofprime：rs…GemomicDNA—SemijmoLicanDiscedstrandDenatu