双荧光素酶报告基因检测系统的开发.docxVIP

Dual-luciferasereporterassaykit ⑴Promega公司双荧光素酶报告基因（DLRtm）检测系统 试剂盒组分： PassiveLysis?Buffer,5x LuciferaseAssayBufferH LuciferaseAssaySubstrate（冻I粉） StopGio?Buffer StopGio?Substrate（冻I粉） Promega的DLRtm检测试剂盒专利给出了Luciferaseassaybuffer!!和StopGlo?buffer的相关组分和浓度范围，没有具体的数值。我在专利和文献中也没有找到针对DLRtm检测试剂盒中的passivelysisbuffer的成分。 Assayprotocol： Assayprotocol： (2)文献中用到的几种非商业性双荧光素报告基因检测系统 25mM 25mM 2mM 2mM 1mg/ml 1% 10% 细胞裂解液(celllysisbuffR方: (a)源自promega公司的单荧光素酶报告试剂盒： Tris-phosphate（PH7.8） EGTAorEDTA dtt BSA TritonX-100 Glycerol(b)Makethefollowingstocksolutions. 1MHEPESpH8(室温RT)1MDTT(4°C)100mMMgCl2(RT)裂解液第二种配方(100ml体系)：来自 /cgi-bin/prot/viewcache.cgi?ID=250710ml1MHEPESPH80.5ml1MDTT2ml100mMMgCl22mlTritonX10085mldistilledwater反应缓冲液：FireflyLuciferaseAssay；RenillaLuciferaseAssayReagent。 a“Anoncommercialdualluciferaseenzymeassaysystemforreportergeneanalysis”文献作者给出了2种荧光素酶活性检测的反应试剂配方，并与promega公司试剂盒进行了效果比较，检测效率和灵敏度都很高，不逊于promega产品。目前也有很多文献采用了该法。细胞裂解液仍使用promega的passivelysisbuffer。 FireflyLuciferaseAssayReagent TOC\o1-5\h\zglycylglycine25mM KxPO4(pH8.0)15mM EGTA4mM DTT1mMATP2mM ATP CoA0.1mM D-luciferin0.075mM thefinalpHadjustedto8.0。 注意：先调PH,防止酶失活。 RenillaLuciferaseAssayReagent： TOC\o1-5\h\zNaCl1.1M Na2EDTA2.2mM KxPO4(pH5.1)0.22M BSA0.44mg/ml NaN31.3mM3 AdjustpHto5.0andadd Coelenterazin(dissolvedinEtOH)1.43pM b FireflyLuciferaseAssayReagent： Tricine20mM (MgCO3)4Mg(OH)25H2O1.07mM MgSO42.67mM EDTA0.1mM DTT33.3mM Add0.001Vof37%HCltodissolvethemagnesiumcarbonate WhenthesolutionbecomesclearadjustthepHto7.8using5MNaOH。 Addremainingcomponents: TOC\o1-5\h\zCoA270pM D-Luciferin,freeacid470pM ATP530pM RenillaLuciferaseAssayReagent： NaCl1.1MKxPO4(pH5.1) KxPO4(pH5.1)BSA NaN31.3mM AdjustpHto5.0andadd Coelenterazin(dissolvedinEtOH)1.43pM(3)试剂盒研发流程，试剂盒检测可以参考复能基因公司开发流程 实验材料：上述试剂采购品种；HEK293细胞；双荧光素酶表达质粒，名称HSPD1野生型靶标克隆(复能基因公司，HmiT009098-MT01)，可以同时表达萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶，来自侯保全采购。 HmiT009098-MT01质粒骨架图谱信息：质粒中包含了萤火虫荧光素酶(fireflyluciferase)和海肾荧光素酶(Renillaluciferase)opUCOriSv4JEnhancer.gmv__ pUCOri Sv4JEnhancer.gmv__x-~(10亟砒—