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土壤中含淀粉酶细菌的分离 苗宇 （河南工业大学国际学院，河南 郑州 450001） 摘要：自然界是微生物的大本营，工业微生物几乎都是从自然界中选育出来的。本文通过梯度稀释法从采取的土壤样品中分离出来含淀粉酶的细菌，并将细菌在富集培养基中进行富集培养后，用稀释平板法分离出酶活性较高的菌株，并根据菌株的生长情况，分析影响其生长的因素。 关键词：梯度稀释法；淀粉酶生产菌；分离；酶活性 1? 引言 酶是生物体内进行生物化学反应的催化剂 ，在生物体中已经发现的酶有2500多种。由于微生物体积小，生长速度快，易于大规模生产，从微生物中制取酶已成为发酵工业中的一个新兴领域。目前，淀粉酶已经运用到医药用消化剂、棉布退浆、水果加工、酒精制造、酒类酿造、味精生产、抗生素工业、淀粉加工、生化试剂等方面。特别是60年代以来，由于酶法生产葡萄糖，以及用葡萄糖生产异构酶浆的大规模工业化，使淀粉酶的需要量越来越大，几乎占整个酶总产量的一半以上。 我国在淀粉酶生产、研究和应用方面都做了大量工作，取得了很大的成绩。特别是在国家的“863”计划中，重点支持了饲料生物添加剂的研究和开发，特别是植酸酶、淀粉酶和木聚糖酶等酶制剂的研究。不仅在国内，外国对酶制剂的研究也十分广泛，如在淀粉连续液化喷射技术、天然有机高分子絮凝剂、非淀粉多糖制剂等的研究与实际应用。 本文通过采样、加热处理后增值培养，在滴加碘液后并根据平板培养基上透明圈的鉴别、分离筛选出含淀粉酶的细菌。 2、材料与方法 2.1 材料 2.1.1 培养基配制的材料与试剂 可溶性红薯淀粉2.5g，琼脂粉11.25g，自来水. 2.1.2 玻璃器皿 平板培养皿（10个），烧杯、三角瓶、玻璃珠（20粒）、量筒（100ml）、移液管（1ml，10ml）、试管（10支）. 2.1.3 样品 实验室预先准备好的土壤10g. 2.2 方法 2.2.1 培养基制备 称取11.25g营养琼脂粉和2.5g水溶性红薯淀粉放入三角瓶中，随后加入适量自来水，在电炉上加热煮沸后，定容为250ml，加装棉塞，包扎后并采用高压进行灭菌。 2.2.2 细菌分离方法 称取样品 10 g放入装有 90 mL无菌水及 20颗玻璃珠的三角瓶中 ,剧烈振荡 10 min使样品颗粒分散均匀.静置 5 min后 ,吸取 1 mL上层悬液于 9 mL无菌水中 ,即成 10-2倍稀释液,用同样方法制成 10-2～10-6稀释度的两组各5支样品悬液，其中一组至于沸水中加热5min，除去一些不耐高温的杂菌。 2.2.3 培养方法 分别取合适稀释度的悬液 1 mL于灭菌平板上 ,再倒入约 25 mL灭菌后的筛选培养基并摇晃均 ,待凝固后倒置于 30 ℃ 恒温生化培养箱中培养2-3天。 2.2.4 含淀粉酶细菌的鉴别方法 将培养好的菌种取出，分别向培养皿中滴加碘液并摇匀，稍等片刻后，周围产生透明圈的即为含淀粉酶的细菌。 3? 结果与讨论 3.1 稀释度对土壤细菌菌落形成的影响 用营养琼脂培养基分别培养不同稀释度的土壤菌悬液，结果（图1）表明，10-2、10-3、10-4、10-5、10-6稀释度中形成的菌落数分别为421、350、280、137、89，其相差的倍数分别为1.2、1.25、2.0、1.5，即不同菌悬液稀释度之间没有严格的比例关系，其原因可能是土壤菌在溶液中的分布式不均匀的，以至于不同稀释度的溶液中的土壤菌的数目不成严格的比例关系，最终导致在营养琼脂培养基上生长的土壤菌的数目之间没有严格的比例关系。虽然不同稀释度的悬液中土壤菌的数目没有严格的比例关系，但其数目成正相关。 3.2 土壤中有淀粉酶活性细菌的比例 为了了解土壤中含淀粉酶菌株的比例，选择了营养琼脂培养基培养基由于淀粉培养基中只有淀粉为唯一碳源，因此，在该培养基中能生长良好的细菌一般均具淀粉酶活性。试验的结果如表2所示，按照10-2、10-3、10-4、10-5、10-6稀释度中的菌落数计算，所采集土壤样品中具淀粉酶活性的细菌比例在20.2%-32.1%之间。从这一结果可以看出，在土壤中含有的细菌中大多数细菌均不能产生淀粉酶，而产淀粉酶细菌的数量仅为少数。不能产淀粉酶的细菌之所以能够正常生存，可能是由于培养基中含有除淀粉外的其他的能被不含淀粉酶细菌作为碳源的物质。 表2 土壤中具有淀粉酶活性的细菌菌落数 稀释度 培养基中具有淀粉酶活性细菌菌落数 菌落总数 10-2 135 421 10-3 89 350 10-4 64 280 10-5 18 137 10-6 22 89 ? ? ? 3.3 菌悬液加热处理对淀粉酶活性细菌比例的影响 将菌悬液进行加热100℃处理，然后按常规方法作稀释和培养，结果表明（图3），加热可显著降低菌悬液中的细菌数量，但具有淀粉酶活性的细菌比例由25.1%提高到45.1％，