大黄鱼头肾巨噬细胞分离和原代培养方法及其应用[发明专利].pdfVIP

(19)中华人民共和国国家知识产权局 *CN102533651A* (12)发明专利申请 (10)申请公布号 CN 102533651 A (43)申请公布日 2012.07.04 (21)申请号 201210018785.6 (22)申请日 2012.01.20 (71)申请人 中国海洋大学 地址 266100 山东省青岛市崂山区松岭路 238 号 (72)发明人 李庆飞 艾庆辉 麦康森 徐玮 郑岳夫 (74)专利代理机构 青岛海昊知识产权事务所有 限公司 37201 代理人 崔清晨 (51)Int.Cl. C12N 5/0786 (2010.01) C12Q 1/02 (2006.01) 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 2 页 权利要求书1 页 说明书3 页 附图2 页 (54)发明名称 大黄鱼头肾巨噬细胞分离和原代培养方法及 其应用 (57)摘要 一种大黄鱼头肾巨噬细胞体外模型的构建 技术，其特征是利用31％/45 ％梯度的Percoll 水平离心分离鱼类头肾巨噬细胞，并在22℃条件 下培养在每升含有50ml 胎牛血清、10 万UI 青链 霉素、5 万UI 肝素、10mmol4- 羟乙基哌嗪乙磺酸 (HEPES)和0.5g 葡萄糖，pH 为7.4 的L15 复合培 养基中。本发明具有如下优点：(1)31％/45％的 Percoll 梯度离心分离的大黄鱼头肾巨噬细胞在 所分离细胞中的比例高达42％；(2)经过夜培养 后贴壁大黄鱼头肾巨噬细胞的纯度高达90％以 上；(3)培养一周后的大黄鱼头肾巨噬细胞存活 率在58％以上；(4)功能验证实验证实：LPS 可以 显著影响所培养的大黄鱼头肾巨噬细胞的吞噬功 A 能和呼吸爆发活性。 1 5 6 3 3 5 2 0 1 N C CN 102533651 A 权 利 要 求 书 1/1 页 1. 一种大黄鱼头肾巨噬细胞分离和原代培养方法，其特征在于，首先用31％/45％梯 度的Percoll 分离液分离出大黄鱼头肾巨噬细胞，再用L15 复合细胞培养基在20 ～25℃下 对分离出的大黄鱼头肾原代巨噬细胞进行培养。 2. 如权利要求 1 所述的方法，其特征在于所述的Percoll 分离液中31 ％和45 ％ Percoll 的体积百分数范围分别为35-55％和45-65％。 3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的L15 复合细胞培养基，其配方如下：每 升培养基中含有50ml 胎牛血清、10 万UI 青链霉素、5 万UI 肝素、10mmol 4- 羟乙基哌嗪乙 磺酸和0.5g 葡萄糖，pH 为7.4。 4. 权利要求1 所述方法制备大黄鱼原代巨噬细胞的应用，是用于检测营养素对离体细 胞免疫力的影响。 2 2 CN 102533651 A 说 明 书 1/3 页 大黄鱼头肾巨噬细胞分离和原代培养方法及其应用 技术领域 [0001] 本发明属于细胞模型技术领域，具体涉及一种大黄鱼头肾巨噬细胞分离和原代培 养方法及其应用。 背景技术 [0002] 大黄鱼(Larmichthys crocea)是中国特有的地方性鱼种，广泛分布于我国近海海 域。由于大黄鱼肉质细嫩、味